防收缩的全层皮肤模型的构建方法与流程

本技术涉及组织工程，更具体地说，它涉及一种防收缩的全层皮肤模型的构建方法。

背景技术：

1、3d全层皮肤模型是应用细胞生物学、工程学的技术和原理，在体外利用人正常皮肤细胞构建由表皮层、真皮层组成，具有完整三维解剖结构，高度模拟人体皮肤和生理功能的组织模型。随着人们对实验动物福利的重视和3r原则的广泛认可，用于化妆品安全性评价和功效评价的实验动物已经逐渐被组织工程皮肤模型所替代。

2、目前存在一种3d双层皮肤模型的构建方法，公开了真皮层由纤维细胞和胶原基质构成。

3、但上述3d双层皮肤模型，随着纤维细胞的生长和繁殖，模型构建初期所提供的胶原会不断地降解，且依赖于其本身质地柔软的特性，导致降解后的胶原基质无法支撑细胞间的拉力，全层细胞模型的真皮层往往会发生不规则收缩，严重影响皮肤模型的品质和均一性，从而影响后续的样品测试。

技术实现思路

1、为了减少全层皮肤模型的收缩现象，本技术提供一种防收缩的全层皮肤模型的构建方法。

2、本技术提供的防收缩的全层皮肤模型的构建方法采用如下的技术方案：

3、一种防收缩的全层皮肤模型的构建方法，包括如下步骤：

4、(一)胶原-明胶支架的制备：将胶原-明胶混合液冷冻、冷冻干燥，与edc-nhs溶液交联反应，洗涤、冷冻干燥，即得胶原-明胶支架；

5、(二)真皮层结构的构建：将含有成纤维细胞的胶原溶液加入到含有胶原-明胶支架的transwell小室中，孵育至胶原成胶，加入培养基a，进行真皮培养，得到真皮层，培养结束后吸去培养基a；

6、所述培养基a以dmem培养液为基础液，添加有胎牛血清；

7、(三)表皮接种：向真皮层表面接种表皮细胞，进行表皮培养；

8、(四)共培养：将表皮培养产物进行气液培养，即得。

9、通过采用上述技术方案，将胶原-明胶混合液先进行冷冻，再冷冻干燥，使所得胶原-明胶支架(以下简称支架)具有较高的吸水率和孔隙率，使得细胞能够很好地粘附在支架表面，且所制支架多孔结构均匀，从而使得细胞在支架表面形成均匀的真皮层。使用edc-nhs溶液与胶原-明胶混合液发生交联反应，提高支架的机械强度，以向成纤维细胞提供足以抵消收缩的支撑力，进而减少真皮层收缩现象的发生，保障皮肤模型的品质和均一性，更好的应用于样品测试中；

10、将以本技术的构建方法制得的模型进行性能检测，其收缩率仅为13.19％，而未使用支架的模型，其收缩率高达56.56％，表明使用本技术所制支架，能够显著降低模型的收缩率，证明上述观点。

11、而仅将胶原-明胶混合液进行一次冷冻，支架孔隙率低，细胞在支架表面的增值、分化效果较差，收缩率相较于二次冷冻时的13.19％提升至25.39％；而当胶原-明胶混合液在干燥后未进行交联，支架机械强度不足，收缩率相较于交联时的13.19％提升至32.83％；由此表明，仅当使用本技术所制支架，能够显著降低模型的收缩率。

12、可选的，胶原-明胶支架的制备过程中，将胶原-明胶混合液进行冷冻、冷冻干燥的条件为：将胶原-明胶混合液在-75～-85℃下冷冻8-12h、再于-75～-85℃冷冻干燥14-18h。

13、通过采用上述技术方案，将以本技术的构建方法制得的模型进行性能检测，当冷冻、冷冻干燥条件处于上述范围外时，收缩率为13.19％，当冷冻、冷冻干燥条件处于上述范围内时，其收缩率降至9.86-10.15％。

14、表明控制冷冻和冷冻干燥条件，使所制支架一方面具有较高的孔隙率，从而提高细胞的附着效果，另一方面具有较高的孔间连接强度，从而具有较高的机械强度，进一步降低模型的收缩率。

15、可选的，胶原-明胶支架的制备过程中，胶原-明胶混合液与edc-nhs溶液交联反应的条件为：于3-5℃下交联反应1.5-2.5h。

16、通过采用上述技术方案，将以本技术的构建方法制得的模型进行性能检测，当交联反应条件处于上述范围外时，收缩率最低为9.86％，当交联反应条件处于上述范围内时，其收缩率降至7.20-7.42％。

17、表明控制交联反应条件，使交联反应程度完全，此条件下所制支架的机械强度高，模型收缩率进一步降低。

18、可选的，所述胶原-明胶混合液，其制备原料包括胶原溶液、明胶溶液，其中，胶原溶液的浓度为0.2％-1％(w/v)，明胶溶液的浓度为0.2％-2％(w/v)。

19、通过采用上述技术方案，当控制胶原浓度、明胶浓度处于上述范围内时，所制支架的机械性能较强，可支撑细胞抵消更大的收缩力，进一步减模型收缩的情况发生，使所制模型的收缩率降至6.54-6.88％。

20、可选的，edc-nhs溶液为edc-nhs的乙醇溶液，其中，edc、nhs的添加量与乙醇的重量比为(5-15)mg:(2-3)mg:1ml；

21、胶原-明胶支架的制备过程中，冷冻干燥产物的添加量与edc-nhs溶液的重量比为1mg:(0.08-0.12)ml。

22、通过采用上述技术方案，控制冷冻干燥产物与edc-nhs溶液的重量比处于上述范围，以控制支架干燥过程中的收缩率处于较低的范围内，消除支架可能发生少量收缩的隐患，进一步减少模型收缩的现象发生，使所制模型的收缩率仅为5.73-5.97％。

23、可选的，所述含有成纤维细胞的胶原溶液，其细胞密度为0.5-1×105/ml。

24、通过采用上述技术方案，当细胞密度在上述范围内时，可较为均匀地分布在支架当中，便于增值与分化，随培养时间的加长，可逐渐观察到细胞间紧密连接，形成片状结构，有助于形成有完整真皮结构的全层皮肤模型；

25、将以本技术的构建方法制得的模型进行性能检测，模型收缩率仅为5.24-5.36％，电阻值在30-31kω/cm2之间，本技术的全层皮肤模型构建方法能有效构建具有一定屏障功能的全层皮肤。

26、可选的，表皮接种的具体方法为：将使用胰酶消化后的表皮细胞，使用培养基b调节细胞密度，再接种到真皮层表面；在transwell下层中加入培养基b，进行表皮培养，培养结束后吸去培养基b；

27、培养基b以k-sfm培养液为基础液。

28、可选的，所述培养基b，以k-sfm培养液为基础液，还添加有牛垂体提取物、牛血清白蛋白、硒、转铁蛋白、乙醇胺、胰岛素、表皮生长因子、氢化可的松、抗坏血酸、氯化钙；

29、所述培养基b中牛垂体提取物浓度为1-50μg/ml、牛血清白蛋白质量百分比为0.1％-5％、硒的浓度为1-50μg/ml、转铁蛋白浓度为1-50μg/ml、乙醇胺浓度为1-50μg/ml、胰岛素浓度为1-50μg/ml、表皮生长因子浓度为0.1-1ng/ml、氢化可的松浓度为0.1-5μg/ml、抗坏血酸浓度为1-50μg/ml、氯化钙浓度为0.03-0.5mm。

30、通过采用上述技术方案，通过使用上述物质组成的培养基b，为细胞增值和分化提供充足的营养物质，全层皮肤模型培养效果较好，电阻值高。

31、可选的，所述调整细胞密度至1×106-6×106/ml。

32、通过采用上述技术方案，当调整细胞密度处于上述范围内时，接种后的角质细胞分布均匀，有利于真皮层的增值和分化，所制全层皮肤模型的收缩率低，电阻值高。

33、可选的，所述气液培养，其使用的培养基为培养基c，以k-sfm培养液为基础液，添加有牛垂体提取物、牛血清白蛋白、硒、转铁蛋白、乙醇胺、胰岛素、表皮生长因子、氢化可的松、油酸、亚油酸、抗坏血酸、氯化钙；

34、所述培养基c中牛垂体提取物浓度为1-50μg/ml、牛血清白蛋白质量分数为0.1-5％、硒浓度为1-50μg/ml、转铁蛋白浓度为1-50μg/ml、乙醇胺浓度为1-50μg/ml、胰岛素浓度为1-50μg/ml、表皮生长因子浓度为0.1-1ng/ml、氢化可的松浓度为0.1-5μg/ml、油酸浓度为0.1-5μg/ml、亚油酸浓度为0.1-5μg/ml、抗坏血酸浓度为1-50μg/ml、氯化钙浓度为1-2mm。

35、通过采用上述技术方案，当培养基c各成分含量处于上述范围内时，全层皮肤模型培养效果较好，电阻值高。

36、综上所述，本技术具有以下有益效果：

37、1、本技术中通过建立胶原-明胶支架材料，并由成纤维细胞和角质细胞构建成皮肤模型，使得支架支撑成纤维细胞，抵抗由于胶原降解引发的收缩现象，降低模型收缩率；

38、2、本技术中通过在支架制备过程中，对胶原-明胶混合液依次进行冷冻、冷冻干燥，降低模型收缩率；

39、3、本技术中通过在支架制备过程中，促使胶原-明胶混合液发生进行交联反应，降低模型收缩率。