一种用于人腺病毒核酸检测的引物组、试剂盒及方法与流程

本发明公开了一种引物探针组合物、包含试剂盒及其检测方法，属于病毒检测。本发明提供的引物探针组合包括针对人腺病毒的特异性引物和探针，采用本发明的试剂盒，q-pcr的方法可以实现对人腺病毒的高特异性、高灵敏度、高效率的检测。

背景技术：

1、人腺病毒(human adenovirus，hadv)是一种无包膜球形dna病毒颗粒，直径65～90nm，由252个壳粒呈20面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链dna分子，约含4.7kb。基于基因组和血清型分析，共a～g 7个亚属，103个类型。其中a、f和g亚属主要引起消化道感染和腹泻，c、e和部分b亚属主要引起呼吸道疾病，其他b亚属主要引起尿路感染，d亚属主要引起角膜炎和结膜炎。

2、现有技术中，目前人腺病毒检测的主要方法包括病原体分离培养法、酶联免疫法、胶体金法和分子诊断等方法。病毒分离培养是目前病毒病原学检测的金标准，但是对标本的采集、运输及保存条件要求均较高，且操作复杂、耗时长、不稳定、敏感性不高，不适合临床检测应用；免疫法的特异性高，但灵敏度较低，且往往不可用于疾病的早期诊断；而实时荧光定量pcr技术是目前应用最广泛的分子诊断方法，该技术不仅实现了对核酸模板的定量检测，而且具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高的优点。但是，现有用于人腺病毒的试剂盒检测效率及灵敏度低，难以实现滴度微量的病毒检测；且不能覆盖腺病毒全部亚属，容易造成漏检，影响后续疾病的诊断及治疗。cn111549178a公开了一种人类腺病毒通用核酸检测试剂盒及方法，其靶基因序列为人腺病毒hexon基因，但仍存在灵敏度低的缺陷。

3、综上，迫切需要开发一种能检测人腺病毒全部亚属、兼顾灵敏度、检测效率的人腺病毒核酸检测的引物组和技术。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中的上述不足，本发明提供了一种用于人腺病毒核酸检测的引物组、试剂盒及方法。本发明所提供的引物组可以覆盖腺病毒全部亚属，解决了现有技术中试剂盒覆盖型别少、检测效率低、特异性差以及灵敏度低的问题。

2、为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种用于人腺病毒核酸检测的引物组，其上游引物的序列如seq id no：1所示，下游引物的序列如seq id no：2所示.

3、一种用于人腺病毒核酸检测的探针，其序列如seq id no：3所示。

4、优选地，所述探针的5’端和3’端分别标记fam和bhq1。

5、经ncbi比对，本发明的靶基因序列为人腺病毒penton基因；可覆盖人腺病毒全部亚属。

6、在本发明的第二方面，提供了一种用于人腺病毒核酸检测的试剂盒，包括pcr缓冲液、dntps、dna聚合酶和ung酶，还包括上述的引物组。

7、优选地，所述试剂盒还包括阳性质控和阴性质控；所述阳性质控为灭活的含人腺病毒基因片段的培养物；所述阴性质控为灭活的内标基因片段；所述内标为人β-actin。

8、优选地，所述试剂盒还包括用于内标基因片段扩增的上下游引物和用于检测内标的探针；所述用于内标基因片段扩增的上下游引物的序列分别如seq id no：4和5所示；所述用于检测内标的探针的序列如seq id no：6所示，所述探针的5’端和3’端分别标记cy5和bhq2。

9、在本发明的第三方面，提供了一种用于人腺病毒核酸检测的pcr扩增反应液，其包括：pcr缓冲液、dntps、上述的引物组；所述反应液各组分的配比如下：

10、

11、在本发明的第四方面，还提供了一种用于人腺病毒核酸检测的方法，将上述pcr反应液、dna聚合酶和ung酶按以下反应体系的配比配制成核酸扩增反应混合液进行pcr反应。

12、所述引物探针组如前所述；所述反应体系的配比如下：

13、

14、所述pcr反应按如下程序进行：

15、ung酶反应：50℃，3～5min

16、预变性：95℃，1～3min

17、

18、需要说明的是，本发明所涉及的核酸检测方法用于非诊疗目的。

19、本发明所述引物探针序列如下：

20、seq id no:1 5’-cattaccaccgtcagtgaaaacg-3’

21、seq id no:2 5’-ggcgtctggcgtcagtaa-3’

22、seq id no:3 5’-cctgctctcacagatcacgggacc-3’

23、seq id no:4 5’-acagagcctcgcctttgc-3’

24、seq id no:5 5’-catgccggagccgttgtc-3’

25、seq id no:6 5’-atccgccgcccgtccaca-3’

26、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

27、本发明提供的引物探针组可以覆盖腺病毒全部亚属，可有效避免漏检。

28、本发明提供的试剂盒含有ung酶防污染体系，可有效避免因核酸片段污染造成的假阳性。

29、本发明提供的试剂盒、检测方法具有操作简便、快速、实时等优点，且灵敏度高，特异性好。

技术特征：

1.一种用于人腺病毒核酸检测的引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如seq id no：1所示，所述下游引物的序列如seq id no：2所示。

2.一种用于人腺病毒核酸检测的探针，其特征在于，所述探针的序列如seq id no：3所示。

3.根据权利要求2所述的一种用于人腺病毒核酸检测的探针，其特征在于，所述探针的5’端和3’端分别标记fam和bhq1。

4.一种用于人腺病毒核酸检测的试剂盒，其特征在于，包括pcr缓冲液、dntps、dna聚合酶和ung酶，还包括权利要求1所述的引物以及权利要求2-3任一项所述的探针。

5.根据权利要求4所述的一种用于人腺病毒核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控和阴性质控；所述阳性质控为灭活的含人腺病毒基因片段的培养物；所述阴性质控为灭活的内标基因片段；所述内标为人β-actin。

6.根据权利要求5所述的一种用于人腺病毒核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于内标片段扩增的上下游引物和用于检测内标的探针；所述用于内标片段扩增的上下游引物的序列分别如seq id no：4和5所示；所述用于检测内标的探针的序列如seqid no：6所示，所述探针的5’端和3’端分别标记cy5和bhq2。

7.一种用于人腺病毒核酸检测的pcr反应液，其特征在于，包括：pcr缓冲液、dntps、如权利要求1所述的用于人腺病毒核酸检测的引物、如权利要求2-3任一项所述的探针、如权利要求6中所述的用于内标核酸检测的引物和探针；具体包括如下组分：

8.一种用于人腺病毒核酸检测的方法，其特征在于，将如权利要求7所述的pcr反应液、dna聚合酶和ung酶以及样本核酸配制成核酸扩增反应混合液进行pcr反应。

9.根据权利要求8所述的一种用于人腺病毒核酸检测的方法，其特征在于，所述pcr反应的体系的配比如下：

10.根据权利要求8所述的一种用于人腺病毒核酸检测的方法，其特征在于，所述pcr反应按如下程序进行：

技术总结
本发明公开了一种用于人腺病毒检测的引物组、试剂盒及方法，所述引物组包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO：3所示。本发明提供的引物探针组可以覆盖腺病毒全部亚属，可有效避免漏检。本发明提供的试剂盒含有UNG酶防污染体系，可有效避免因核酸片段污染造成的假阳性。本发明提供的试剂盒、检测方法具有操作简便、快速、实时等优点，且灵敏度高，特异性好。

技术研发人员：李娇娇
受保护的技术使用者：广州科方生物技术股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13