一种变速悬浮诱导人多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法与流程

本发明属于细胞生物学领域，尤其是涉及一种变速悬浮诱导人多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法。

背景技术：

1、目前nk细胞来源主要是外周血单个核细胞，脐血单个核细胞，nk92细胞系及多能干细胞诱导来源的nk细胞。外周血及脐血单个核来源的nk细胞主要存在的问题是细胞数量有限，细胞纯度较低及细胞存在个体差异造成实验结果不稳定。nk92细胞染色体为非整倍体，因此使用前需要进行辐照，影响细胞存活时长及功能发挥。多能干细胞由于其可以无限扩增获得大量的起始细胞，且细胞均一稳定，通过诱导分化的nk细胞纯度较高，批次稳定，且具有nk细胞的表型及功能，因此，可以实现nk细胞的实验室培养转化为工业规模化生产，利于推进细胞向临床应用。

2、目前，多能干细胞诱导分化nk细胞主要的方法有单层细胞诱导分化nk细胞的2d技术及低吸附96孔板产生spin-eb诱导的方法。2d诱导技术目前仍需要依赖异源基质细胞或者需要蛋白包被进行诱导分化，且诱导的nk细胞杀伤功能较差，诱导周期长，不利于nk的规模化培养。spin-eb的方法存在操作繁杂，批间差异大，稳定性差，且耗材昂贵，同样不适合规模化生产等问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种变速悬浮诱导人多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法。

2、为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

3、一种变速悬浮诱导人多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法，包括如下步骤：

4、s1：变速阶段一

5、将人多能干细胞配制细胞悬液，放入细胞培养容器中置于37℃，5%co2，常规氧分压环境以40-80rpm转速培养18-48h；

6、s2：变速阶段二

7、将步骤s1培养后的细胞离心收集，加入变速阶段二诱导分化培养基后于37℃，2%-8%氧分压环境中以15-50rpm转速培养进行诱导分化3-6天；

8、s3：变速阶段三

9、将变速阶段二诱导分化培养基更换为变速阶段三诱导分化培养基，于37℃，5%co2，常规氧分压环境中以10-40rpm转速培养进行诱导分化2-3天；

10、s4：变速阶段四

11、将变速阶段三诱导分化培养基更换为变速阶段四诱导分化培养基，并于37℃，5%co2，常规氧分压环境以0-30rpm转速培养进行诱导分化5-9天；

12、s5：变速阶段五

13、将变速阶段四诱导分化培养基更换为变速阶段五诱导分化培养基，并置于37℃，5%co2，常规氧分压环境以0-50rpm转速培养进行诱导分化21-35天。

14、其中，常规氧分压环境是指与大气中氧含量相同的环境。

15、在本发明的部分实施例中，所述步骤s1中的转速优选为50rpm。

16、在本发明的部分实施例中，所述步骤s2中的转速优选为20rpm。

17、在本发明的部分实施例中，所述步骤s3中的转速优选为20rpm。

18、在本发明的部分实施例中，所述步骤s4中的转速优选为10rpm。

19、在本发明的部分实施例中，所述步骤s5中的转速优选为10-40rpm。

20、在本发明的部分实施例中，所述步骤s1中放入细胞培养容器中的细胞悬液密度为0.5-2×106/ml，优选细胞密度为0.5-1×106/ml，更优选细胞密度为5×105/ml，

21、在本发明的部分实施例中，所述步骤s2中的变速阶段二诱导分化培养基中含有gsk3β抑制剂、bmp信号通路激活剂、vegf、scf、 bfgf、igf-1中的一种或几种。

22、在本发明的部分实施例中，所述步骤s2中的变速阶段二诱导分化培养基为含有gsk3β抑制剂、bmp信号通路激活剂、vegf、scf、 bfgf、igf-1中的一种或几种的基础诱导分化培养基。

23、在本发明的一些实施方式中，所述变速阶段二诱导分化培养基中gsk3β抑制剂的浓度为1-10μm，bmp信号通路激活剂的浓度为1-100ng/ml，vegf的浓度为1-100ng/ml，scf的浓度为1-200ng/ml，bfgf的浓度为1-50ng/ml，igf-1的浓度为1-200ng/ml。

24、在本发明的部分实施例中，所述步骤s3中的变速阶段三诱导分化培养基中含有tgf-β信号通路抑制剂、bmp信号通路激活剂、vegf、bfgf、scf、flt3l、il3、il6、igf-1中的一种或几种。

25、在本发明的部分实施例中，所述步骤s3中的变速阶段三诱导分化培养基为含有tgf-β信号通路抑制剂、bmp信号通路激活剂、vegf、bfgf、scf、flt3l、il3、il6、igf-1中的一种或几种的基础诱导分化培养基。

26、在本发明的一些实施方式中，所述变速阶段三诱导分化培养基中tgf-β信号通路抑制剂的浓度为1-10μm，bmp信号通路激活剂的浓度为1-100ng/ml，vegf的浓度为1-100ng/ml，bfgf的浓度为1-50ng/ml，scf的浓度为1-200ng/ml，flt3l的浓度为1-100ng/ml，il3的浓度为1-50ng/ml，il6的浓度为1-50ng/ml，igf-1的浓度为1-200ng/ml。

27、在本发明的部分实施例中，所述步骤s4中的变速阶段四诱导分化培养基中含有bmp4、vegf、bfgf、scf、flt3l、il3、il6、igf-1、um171、um729、sr1中的一种或几种。

28、在本发明的部分实施例中，所述步骤s4中的变速阶段四诱导分化培养基为含有bmp4、vegf、bfgf、scf、flt3l、il3、il6、igf-1、um171、um729、sr1中的一种或几种的基础诱导分化培养基。

29、在本发明的一些实施方式中，所述变速阶段四诱导分化培养基中bmp4的浓度为1-100ng/ml，vegf的浓度为1-100ng/ml，bfgf的浓度为1-50ng/ml，scf的浓度为1-200ng/ml，flt3l的浓度为1-100ng/ml，il3的浓度为1-50ng/ml，il6的浓度为1-50ng/ml，igf-1的浓度为1-200ng/ml，um171的浓度为10-50nm，um729的浓度为100-900nm，sr1的浓度为100-900nm。

30、在本发明的部分实施例中，所述步骤s5中的变速阶段五诱导分化培养基中含有il3、il7、il15、scf、flt3l、um729、il2、il21、il12、il18、chir99021中的一种或几种。

31、在本发明的部分实施例中，所述步骤s5中的变速阶段五诱导分化培养基为含有il3、il7、il15、scf、flt3l、um729、il2、il21、il12、il18、chir99021中的一种或几种的基础诱导分化培养基。

32、在本发明的一些实施方式中，所述变速阶段五诱导分化培养基中il3的浓度为1-100ng/ml，il7的浓度为1-100ng/ml，il15的浓度为1-100ng/ml，scf的浓度为1-100ng/ml，flt3l的浓度为1-100ng/ml，mu729的浓度为100-900nm，il2的浓度为1-1000u/ml，il21的浓度为1-100ng/ml，il12的浓度为1-100ng/ml，il18的浓度为1-100ng/ml，chir99021的浓度为1-10um。

33、在本发明的部分实施例中，所述步骤s2中加入变速阶段二诱导分化培养基后每2天半量更换变速阶段二诱导分化培养基。

34、在本发明的部分实施例中，所述步骤s5中加入变速阶段五诱导分化培养基后每3-7天半量更换变速阶段五诱导分化培养基。

35、在本发明的部分实施例中，所述步骤s5的具体步骤为：

36、s51：离心收集步骤s4诱导分化的细胞，向沉淀中加入变速阶段五诱导分化培养基m1，并置于37℃，5%co2，常规o2分压环境以10-50rpm进行诱导分化，变速阶段五诱导分化培养基m1为在基础诱导分化培养基加入il3、il7、il15、scf、flt3l中的一种或几种；

37、s52：离心收集步骤s51诱导分化的细胞，每5天半量换液变速阶段五诱导分化培养基m2，并置于37℃，5%co2，常规o2分压环境以10-50rpm进行诱导分化，变速阶段五诱导分化培养基m2为在基础诱导分化培养基加入il7、il15、scf、flt3l中的一种或几种；

38、s53：离心收集步骤s52诱导分化的细胞，每3-4天半量换液变速阶段五诱导分化培养基m3，并置于37℃，5%co2，常规o2分压环境以10-50rpm进行诱导分化，变速阶段五诱导分化培养基m3为在基础诱导分化培养基加入il7、il15、scf、flt3l、um729、il2、il21、il12、il18中的一种或几种；

39、s54：离心收集步骤s53诱导分化的细胞，每3-4天半量更换变速阶段五诱导分化培养基m4，并置于37℃，5%co2，常规o2分压环境以10-50rpm进行诱导分化，变速阶段五诱导分化培养基m4为在基础诱导分化培养基加入il7、il15、scf、flt3l、um729、il2、il21、il12、il18、chir99021中的一种或几种。

40、在本发明的部分实施例中，所述变速阶段五诱导分化培养基m1中il3的浓度为1-100ng/ml，il7的浓度为1-100ng/ml，il15的浓度为1-100ng/ml，scf的浓度为1-100ng/ml，flt3l的浓度为1-100ng/ml。

41、在本发明的部分实施例中，所述变速阶段五诱导分化培养基m2中il7的浓度为1-100ng/ml，il15的浓度为1-100ng/ml，scf的浓度为1-100ng/ml，flt3l的浓度为1-100ng/ml。

42、在本发明的部分实施例中，所述变速阶段五诱导分化培养基m3中il7的浓度为1-100ng/ml，il15的浓度为1-100ng/ml，scf的浓度为1-100ng/ml，flt3l的浓度为1-100ng/ml，um729的浓度为100-900nm，il2的浓度为1-1000u /ml，il21的浓度为1-100ng/ml，il12的浓度为1-100ng/ml，il18的浓度为1-100ng/ml。

43、在本发明的部分实施例中，所述变速阶段五诱导分化培养基m4中il7的浓度为1-100ng/ml，il15的浓度为1-100ng/ml，scf的浓度为1-100ng/ml，flt3l的浓度为1-100ng/ml，um729的浓度为100-900nm，il2的浓度为1-1000u/ml，il21的浓度为1-100ng/ml，il12的浓度为1-100ng/ml，il18的浓度为1-100ng/ml，chir99021的浓度为1-10μm。

44、在本发明的部分实施例中，所述步骤s51中的转速优选为10rpm，所述步骤s52中的转速优选为10rpm，所述步骤s53中的转速优选为40rpm，所述步骤s54中的转速优选为40rpm。

45、在本发明的部分实施例中，步骤s5中变速阶段四的诱导产物通过ntc细胞培养瓶或者细胞培养袋进行诱导培养，或将变速阶段四诱导产物收集后接种于含有0.1%-2%明胶、0.5 µg/cm2层粘连蛋白或者0.5 µg/cm2玻璃粘连蛋白包被的培养瓶进行诱导培养。

46、相对于现有技术，本发明具有以下优势：

47、（1）本发明的变速悬浮诱导方法通过调节不同的转速及起始密度诱导多能干细胞向nk细胞分化，操作方便，适合规模化生产。

48、（2）本发明的变速悬浮诱导方法技术路线稳定，且诱导nk细胞阳性率大于90%，具有和外周血来源的nk细胞同样的表型及体外功能。

49、（3）本发明的变速悬浮诱导方法不依赖于饲养细胞或异源基质胶的使用，经体外实验验证其安全性，有利于细胞向临床使用转化。