一种扩增含乙醇的核酸样本的方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种扩增含乙醇的核酸样本的方法。

背景技术：

1、近年来随着病原体检测热度攀升，病原体核酸检测逐步成为病原体检测的金标准。随着大批量样本短时间内需要出具检测结果，核酸提取的高通量和高效率逐渐成为市场需求，快速提取也逐渐成为实验室的标配。磁珠法快速核酸提取由裂解、洗涤和洗脱等步骤组成，过程中会存在一些杂质残留，例如蛋白，胍盐和醇类，edta等。其中洗涤步骤在提取过程中至关重要，关系到核酸的纯度，而核酸的纯度直接影响下游pcr实验的应用。目前常用的洗涤液含有乙醇类物质，经过多次洗涤，洗脱不彻底则可能会带来乙醇类残留，乙醇类物质对qpcr扩增的平台影响较大，随着乙醇浓度升高，扩增平台逐渐下降。

技术实现思路

1、本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种扩增含乙醇的核酸样本的方法，其能够显著减少提取过程中的乙醇残留对下游扩增的影响。

2、本技术的第一方面提供一种扩增含乙醇的核酸样本的方法，所述方法包括：(1)提供含乙醇的核酸样本；(2)以步骤(1)中的核酸样本为模板，配制qpcr扩增体系；(3)在适宜的条件下进行qpcr扩增反应。

3、在一些实施方案中，所述qpcr扩增体系中乙醇的含量(体积分数)是0.1-10％，优选0.1％-8％，更优选0.1％-7％，包括所述范围内的0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％和7％。

4、在一些实施方案中，所述核酸样本是dna，例如gdna、质粒dna和线粒体dna；优选地，所述dna在qpcr扩增体系中的浓度是0.01-1ng/μl，优选0.01-0.5ng/μl，包括所述范围内的0.01ng/μl，0.02ng/μl，0.03ng/μl，0.04ng/μl，0.05ng/μl，0.06ng/μl，0.07ng/μl，0.08ng/μl，0.09ng/μl，0.1ng/μl，0.15ng/μl，0.2ng/μl，0.25ng/μl，0.3ng/μl，0.35ng/μl，0.4ng/μl，0.45ng/μl和0.5ng/μl。

5、在一些实施方案中，所述核酸样本是rna，例如total rna、mrna、mirna和其他小分子rna；优选地，所述rna在qpcr扩增体系中的浓度是0.01-1ng/μl，优选0.01-0.5ng/μl，包括所述范围内的0.01ng/μl，0.02ng/μl，0.03ng/μl，0.04ng/μl，0.05ng/μl，0.06ng/μl，0.07ng/μl，0.08ng/μl，0.09ng/μl，0.1ng/μl，0.15ng/μl，0.2ng/μl，0.25ng/μl，0.3ng/μl，0.35ng/μl，0.4ng/μl，0.45ng/μl和0.5ng/μl。

6、在一些实施方案中，所述qpcr扩增体系还包括缓冲物质、dntps、金属盐、dna聚合酶、海藻糖、引物、探针和/或荧光染料。

7、在一些实施方案中，所述海藻糖在qpcr扩增体系中的浓度是0.01-5mol/l，优选0.01-2mol/l，更优选0.01-1mol/l，包括所述范围内的0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.04mol/l、0.05mol/l、0.06mol/l、0.07mol/l、0.08mol/l、0.09mol/l、0.1mol/l、0.15mol/l、0.2mol/l、0.25mol/l、0.3mol/l、0.35mol/l、0.4mol/l、0.45mol/l、0.5mol/l、0.55mol/l、0.6mol/l、0.65mol/l、0.7mol/l、0.75mol/l、0.8mol/l、0.85mol/l、0.9mol/l、0.95mol/l和1mol/l。

8、在一些实施方案中，所述缓冲物质包括tris、tris-hcl、tris碱或hepes中的一种或多种，优选tris-hcl，更优选地，所述tris-hcl在qpcr扩增体系中的浓度是5-50mmol/l，包括所述范围内的5mmol/l，10mmol/l，12mmol/l，15mmol/l，18mmol/l，20mmol/l，22mmol/l，25mmol/l，28mmol/l，30mmol/l，32mmol/l，35mmol/l，38mmol/l，40mmol/l，42mmol/l，45mmol/l，48mmol/l和50mmol/l。

9、在一些实施方案中，所述dntps在qpcr扩增体系中的浓度是0.1-1mmol/l，包括所述范围内的0.1mmol/l，0.2mmol/l，0.3mmol/l，0.4mmol/l，0.5mmol/l，0.6mmol/l，0.7mmol/l，0.8mmol/l，0.9mmol/l和1mmol/l。

10、在一些实施方案中，所述金属盐是mg2+盐、k+盐、mn2+盐、na+盐和ca2+盐中的一种或多种；在一些实施方案中，所述金属盐在qpcr扩增体系中的浓度是30-80mmol/l，包括所述范围内的30mmol/l，35mmol/l，40mmol/l，45mmol/l，50mmol/l，55mmol/l，58mmol/l，60mmol/l，62mmol/l，65mmol/l，68mmol/l，70mmol/l，75mmol/l和80mmol/l。

11、在一些实施方案中，所述金属盐包括mg2+盐和k+盐；优选地，所述金属盐包括mgcl2和kcl，更优选的，所述mgcl2在qpcr扩增体系中的浓度是2-10mmol/l，包括所述范围内的2mmol/l，3mmol/l，4mmol/l，5mmol/l，6mmol/l，7mmol/l，8mmol/l，9mmol/l和10mmol/l，所述kcl在qpcr扩增体系中的浓度是30-80mmol/l，包括所述范围内的30mmol/l，32mmol/l，35mmol/l，38mmol/l，40mmol/l，42mmol/l，45mmol/l，48mmol/l，50mmol/l，52mmol/l，55mmol/l，58mmol/l，60mmol/l，62mmol/l，65mmol/l，68mmol/l，70mmol/l，72mmol/l，75mmol/l，78mmol/l和80mmol/l。

12、在一些实施方案中，所述dna聚合酶是耐热dna聚合酶，优选taq dna聚合酶，所述taq dna聚合酶在qpcr扩增体系中的浓度是1-5u/μl，包括所述范围内的1u/μl，1.2u/μl，1.5u/μl，1.8u/μl，2u/μl，2.5u/μl，3u/μl，3.5u/μl，4u/μl，4.5u/μl和5u/μl。

13、在一些实施方案中，所述引物包含至少一对上游引物和下游引物，所述上下游引物在qpcr扩增体系中的浓度是0.2-0.5μmol/l，包括所述范围内的0.2μmol/l，0.3μmol/l，0.4μmol/l和0.5μmol/l。

14、在一些实施方案中，所述探针是taqman探针，所述taqman探针在qpcr扩增体系中的浓度是0.1-0.5μmol/l，包括所述范围内的0.1μmol/l，0.2μmol/l，0.3μmol/l，0.4μmol/l和0.5μmol/l。所述taqman探针包括5’端标记的报告荧光基团(reporter)和3’端标记的淬灭荧光基团(quencher)；所述报告荧光基团是例如fam、vic、hex或tet，所述淬灭荧光基团是例如bhq1、tamra、mgb。

15、在一些实施方案中，所述荧光染料是sybrgreen或evagreentm，优选sybrgreen。

16、在一些实施方案中，所述qpcr扩增反应包括预变性和循环反应；所述预变性的温度是90-98℃，例如92-96℃，例如95℃温育20s-60s，例如25s-40s，例如30s；所述循环反应包括95℃变性8-12s，在55-65℃退火并延伸10-30s，共40-50个循环。

17、在一些实施方案中，当所述核酸样本是rna时，所述qpcr扩增体系还包括逆转录酶，所述逆转录酶包括但不限于本领域已知的一切具有rna指导的dna聚合酶活性的逆转录酶，如mmlv、hiv或amv，优选mmlv逆转录酶，更优选地，所述mmlv逆转录酶在qpcr扩增体系中的浓度是1-10u/μl，包括所述范围内的1u/μl，2u/μl，2.5u/μl，3u/μl，3.5u/μl，4u/μl，4.5u/μl，5u/μl，5.5u/μl，6u/μl，6.5u/μl，7u/μl，7.5u/μl，8u/μl，8.5u/μl，9u/μl，9.5u/μl和10u/μl。

18、在一些实施方案中，当所述核酸样本是rna时，所述qpcr扩增反应是rt(reversetranscription)-qpcr扩增反应/逆转录qpcr，所述rt-qpcr扩增反应包括逆转录、预变性和循环反应；所述逆转录的温度是50-60℃，例如52-58℃，例如55℃温育10-20min，例如12-18min，例如15min；所述预变性的温度是90-98℃，例如92-96℃，例如95℃温育20s-60s，例如25s-40s，例如30s；所述循环反应包括95℃变性8-12s，在55-65℃退火并延伸10-30s，共40-50个循环。

19、在一些实施方案中，所述qpcr扩增体系包括：0.1-10％(体积分数)乙醇，0.01-1ng/μl核酸样本，0.01-5mol/l海藻糖，5-50mmol/l的tris-hcl，0.1-1mmol/l的dntps，2-10mmol/l的mg2+盐，30-80mmol/l的k+盐，1-5u/μl的dna聚合酶，0.2-0.5μmol/l的上下游引物，0.1-0.5μmol/l的探针和任选地1-10u/μl逆转录酶；更优选地，所述qpcr扩增体系包括：0.5-8％(体积分数)乙醇，0.01-0.5ng/μl核酸样本，0.05-2mol/l海藻糖，20-30mmol/l的tris-hcl，0.1-0.5mmol/l的dntps，2-5mmol/l的mgcl2，40-60mmol/l的kcl，1-3u/μl的taqdna聚合酶，0.2-0.4μmol/l的上下游引物，0.1-0.4μmol/l的探针和任选地3-6u/μl的mmlv逆转录酶；最优选地，所述qpcr扩增体系包括：1-5％(体积分数)乙醇，0.1ng/μl核酸样本，0.1-1mol/l海藻糖，20mmol/l的tris-hcl，0.2mmol/l的dntps，3mmol/l的mgcl2，50mmol/l的kcl，2u/μl的taq dna聚合酶，0.2μmol/l的上下游引物，0.2μmol/l的探针和任选地4u/μl的mmlv逆转录酶。

20、在一些实施方案中，所述qpcr扩增体系包括：0.1-10％(体积分数)乙醇，0.01-1ng/μl核酸样本，0.01-5mol/l海藻糖，5-50mmol/l的tris-hcl，0.1-1mmol/l的dntps，2-10mmol/l的mg2+盐，30-80mmol/l的k+盐，1-5u/μl的dna聚合酶，0.2-0.5μmol/l的上下游引物，荧光染料和任选地1-10u/μl逆转录酶；更优选地，所述qpcr扩增体系包括：0.5-8％(体积分数)乙醇0.01-0.5ng/μl核酸样本，0.05-2mol/l海藻糖，20-30mmol/l的tris-hcl，0.1-0.5mmol/l的dntps，2-5mmol/l的mgcl2，40-60mmol/l的kcl，1-3u/μl的taq dna聚合酶，0.2-0.4μmol/l的上下游引物，sybr green荧光染料和任选地3-6u/μl的mmlv逆转录酶；最优选地，所述qpcr扩增体系包括：1-5％(体积分数)乙醇，0.1ng/μl核酸样本，0.1-1mol/l海藻糖，20mmol/l的tris-hcl，0.2mmol/l的dntps，3mmol/l的mgcl2，50mmol/l的kcl，2u/μl的taq dna聚合酶，0.2μmol/l的上下游引物，sybr green荧光染料和任选地4u/μl的mmlv逆转录酶。

21、本技术的第二方面提供海藻糖在提高含乙醇的核酸样本pcr扩增后taq酶保留活性中的用途。

22、在一些实施方案中，所述pcr扩增体系中乙醇的含量(体积分数)是0.1-10％，优选0.1％-8％，更优选0.1％-7％，包括所述范围内的0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％和7％。

23、在一些实施方案中，所述海藻糖在pcr扩增体系中的浓度是0.01-5mol/l，优选0.01-2mol/l，更优选0.01-1mol/l，包括所述范围内的0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.04mol/l、0.05mol/l、0.06mol/l、0.07mol/l、0.08mol/l、0.09mol/l、0.1mol/l、0.15mol/l、0.2mol/l、0.25mol/l、0.3mol/l、0.35mol/l、0.4mol/l、0.45mol/l、0.5mol/l、0.55mol/l、0.6mol/l、0.65mol/l、0.7mol/l、0.75mol/l、0.8mol/l、0.85mol/l、0.9mol/l、0.95mol/l和1mol/l。

24、本技术的第三方面提供海藻糖在提高含乙醇的核酸样本的pcr扩增效率中的用途。

25、在一些实施方案中，所述pcr扩增体系中乙醇的含量(体积分数)是0.1-10％，优选0.1％-8％，更优选0.1％-7％，包括所述范围内的0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％和7％。

26、在一些实施方案中，所述海藻糖在pcr扩增体系中的浓度是0.01-5mol/l，优选0.01-2mol/l，更优选0.01-1mol/l，包括所述范围内的0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.04mol/l、0.05mol/l、0.06mol/l、0.07mol/l、0.08mol/l、0.09mol/l、0.1mol/l、0.15mol/l、0.2mol/l、0.25mol/l、0.3mol/l、0.35mol/l、0.4mol/l、0.45mol/l、0.5mol/l、0.55mol/l、0.6mol/l、0.65mol/l、0.7mol/l、0.75mol/l、0.8mol/l、0.85mol/l、0.9mol/l、0.95mol/l和1mol/l。

27、在一些实施方案中，所述pcr包括但不限于本领域已知的pcr、qpcr和rt-qpcr。

28、本技术的第四方面提供一种pcr扩增反应液，所述反应液包括：0.1-10％(体积分数)乙醇，0.01-1ng/μl核酸样本，0.01-5mol/l海藻糖，5-50mmol/l的tris-hcl，0.1-1mmol/l的dntps，2-10mmol/l的mg2+盐，30-80mmol/l的k+盐，1-5u/μl的dna聚合酶，0.2-0.5μmol/l的上下游引物，0.1-0.5μmol/l的探针和任选地1-10u/μl逆转录酶。

29、在一些实施方案中，所述反应液包括：0.5-8％(体积分数)乙醇，0.01-0.5ng/μl核酸样本，0.05-2mol/l海藻糖，20-30mmol/l的tris-hcl，0.1-0.5mmol/l的dntps，2-5mmol/l的mgcl2，40-60mmol/l的kcl，1-3u/μl的taq dna聚合酶，0.2-0.4μmol/l的上下游引物，0.1-0.4μmol/l的探针和任选地3-6u/μl的mmlv逆转录酶。

30、在一些实施方案中，所述反应液包括：1-5％(体积分数)乙醇，0.1ng/μl核酸样本，0.1-1mol/l海藻糖，20mmol/l的tris-hcl，0.2mmol/l的dntps，3mmol/l的mgcl2，50mmol/l的kcl，2u/μl的taq dna聚合酶，0.2μmol/l的上下游引物，0.2μmol/l的探针和任选地4u/μl的mmlv逆转录酶。

31、本技术的第五方面提供一种pcr扩增反应液，所述反应液包括：0.1-10％(体积分数)乙醇，0.01-1ng/μl核酸样本，0.01-5mol/l海藻糖，5-50mmol/l的tris-hcl，0.1-1mmol/l的dntps，2-10mmol/l的mg2+盐，30-80mmol/l的k+盐，1-5u/μl的dna聚合酶，0.2-0.5μmol/l的上下游引物，荧光染料和任选地1-10u/μl逆转录酶。

32、在一些实施方案中，所述反应液包括：0.5-8％(体积分数)乙醇，0.01-0.5ng/μl核酸样本，0.05-2mol/l海藻糖，20-30mmol/l的tris-hcl，0.1-0.5mmol/l的dntps，2-5mmol/l的mgcl2，40-60mmol/l的kcl，1-3u/μl的taq dna聚合酶，0.2-0.4μmol/l的上下游引物，sybr green荧光染料和任选地3-6u/μl的mmlv逆转录酶。

33、在一些实施方案中，所述反应液包括：1-5％(体积分数)乙醇，0.1ng/μl核酸样本，0.1-1mol/l海藻糖，20mmol/l的tris-hcl，0.2mmol/l的dntps，3mmol/l的mgcl2，50mmol/l的kcl，2u/μl的taq dna聚合酶，0.2μmol/l的上下游引物，sybr green荧光染料和任选地4u/μl的mmlv逆转录酶。