用于检测长春碱类药物基因多态性的探针、引物、试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，具体的说涉及用于检测长春碱类药物基因多态性的探针、引物、试剂盒。

背景技术：

1、长春碱类抗肿瘤药是从夹竹桃科植物长春花中提取分离得到的可干扰蛋白质合成具有抗癌活性的一类生物碱。主要对淋巴瘤、绒毛膜上皮癌及睾丸肿瘤有效，其他对肺癌、乳腺癌、卵巢癌及单核细胞白血病也有效。

2、长春碱类抗肿瘤药的治疗效应存在个体化差异，可通过药物基因检测研究基因组或基因变异对药物的吸收、疗效等影响从而进行个性化精准用药。长春碱类药物细胞毒性是通过与微管蛋白的结合实现的。它们在微管蛋白二聚体上有共同的结合位点，可抑制蛋白质合成与功能、抑制微管聚合成，干扰有丝分裂，妨碍垂体微管的形成，从而使有丝分裂中期停止，进而阻止癌细胞分裂增殖。抗癌药物用量必须准确，如使用药量不足时，可能造成治疗效果不理想；如果使用药量超出安全剂量会导致严重的毒性反应，会给患者身体带来很大伤害。此外长春碱类药物的化学结构是存在差异的，所以与微管蛋白的结合力及结合方式各不相同，所以在临床应用中会出现了不同的抗肿瘤应用、使用剂量及不良反应。

3、长春碱除作用于微管蛋白外，还可干扰蛋白质代谢及抑制rna多聚酶的活力，并抑制细胞膜类脂质的合成和氨基酸在细胞膜的转运。因此除作用于m期外，对g1期也有作用。本品主要由胆汁中排出33％，由尿中排出21％原形。

4、abcb1是acp结合盒b亚家族成员1转运蛋白基因，编码膜结合蛋白p-糖蛋白(p-glycopretein,p-gp)，该蛋白为存在于许多生物细胞膜上的一种药物流出转运蛋白，它能把外源性物质泵出细胞外。因此，该蛋白参与长春新碱的转运外排。abcb1基因特定变异位点rs1045642和rs2032582使得编码的p-gp功能发生紊乱，药物外排泵系统功能发生障碍，药物外排速率受到影响进而影响药物疗效。对于rs1045642位点和rs2032582位点基因型为gg和cc、gg和ct、gg和tt的个体，使用长春新碱的疗效差。

5、研究表明cep7基因多态性位点rs924607基因型cc+ct相比，基因型tt与前体细胞淋巴细胞白血病淋巴瘤患者用长春新碱治疗时周围神经系统疾病的风险增加有关。影响长春碱的毒副作用。对于rs924607位点基因型为cc的个体，使用长春碱的疗效差。

6、针对上述基因多态性检测可作为对长春碱类药物功能的评估指标，具有较重要的意义。目前普遍应用的突变检测方法为dna直接测序法，pcr产物直接进行dna序列分析，可以明确突变位点，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进行检测等缺点。因此，需要开发一种适合大批量样本检测的方法。

技术实现思路

1、本发明提供一种用于检测长春碱类药物基因多态性的探针、引物、试剂盒；通过分子信标多重荧光定量pcr的检测方法，通过同时对多个靶标进行扩增，从而对扩增产物进行检测实现对多个靶标进行诊断。大幅度的提升检测效率，节约成本。

2、本发明的技术方案如下：

3、用于检测长春碱类药物基因多态性的引物探针组，包括以下引物探针组中的任意一种或两种：

4、用于检测长春碱类药物基因多态性的引物探针组，其特征在于，包括以下引物探针组中的任意一种或两种：

5、用于检测abcb1基因多态性的引物探针组，其中：

6、用于检测abcb1基因多态性的探针序列为ccactagaaggtnctgggaaggtgagtgg，如seq id no.1所示；

7、用于检测abcb1基因多态性的引物序列为：

8、seq id no.2 5′-aggtgacactatagaatatgttgtctggacaagcactga-3′

9、seq id no.3 5′-gcaagccctcacgtagcgaagcatagtaagcagtagggagtaacaa-3′；

10、用于检测cep72基因多态性的引物探针组，其中：

11、用于检测cep72基因多态性的探针序列为cctgcagaagacncagtgacagcagg,如seqid no.4所示；

12、用于检测cep72基因多态性的引物序列为：

13、seq id no.5 5′-aggtgacactatagaataagtcttgcaggaggggtcat-3′

14、seq id no.6 5′-gcaagccctcacgtagcgaaggacacacagcgtcacattt-3′。

15、进一步，用于检测abcb1基因多态性的探针的两端以及用于检测cep72基因多态性的探针的两端均加修饰基团，其中，5′的修饰基团为荧光基团，所述荧光基团选自fam、hex、rox、cy5中的一种；3′的修饰基团为淬灭基团，所述淬灭基团选自bhq1或bhq2。

16、进一步，用于检测abcb1基因多态性的探针序列中，n为变异碱基，具体为t>g。

17、进一步，用于检测abcb1基因多态性的探针序列包括环序列和茎序列，其中环序列为第6～30bp，5′-agaaggtnctgggaaggtg-3′(如seq id no.7所示)；其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为5′-ccact……agtgg-3′。

18、进一步，用于检测cep72基因多态性的探针序列中，n为变异碱基，具体为c>t。

19、进一步，用于检测cep72基因多态性的探针序列包括环序列和茎序列，其中环序列为第6～25bp，5′-gatctgcactnaggaatgctga-3′(如seq id no.8所示)，其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为(5′-cccac……gtggg-3′)。

20、本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包含如权利要求1所述的引物探针组；该试剂盒还包含还有taq酶、dntp、和/或mg2+。

21、本发明还提供一用于检测长春碱类药物基因多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

22、(1)提取样本dna；

23、(2)应用权利要求1所述的引物探针组进行荧光定量pcr反应；

24、(3)分析结果，根据扩增曲线，规定合适基线和阈值，基于形成的杂交峰所显示的tm值差异展现不同的基因型。

25、其中pcr反应的总体系为15ul(包括pcr mix 7.5ul、2组正向引物溶液各0.5ul及2组反向引物溶液各0.5ul，2组探针各0.1ul，样本dna 2ul，灭菌重蒸馏水1.1ul)；在荧光定量pcr仪上进行反应，pcr反应条件为92-97℃预变性5-15分钟；92-97℃变性10-30秒，57-65℃退火10-30秒，70-75℃延伸10-30秒，40-50个循环；72℃延伸10分钟；92-97℃变性1分钟，40℃复性1分钟，熔解温度45-80℃过程中实时监测荧光信号，每升温1℃记录5次。

26、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

27、1、本发明利用一种可以特异识别核酸序列的荧光探针，通过与靶序列进行杂交后发生构象的变化而释放荧光染料，根据杂交后产生不同温度的峰图判定分型结果。在没有靶dna存在的情况下，荧光基团与淬灭基团可以稳定地结合在一起，检测不到荧光信号；

28、2、当有靶dna存在时，荧光标记探针结构被破坏，荧光基团与淬灭基团相互分离，即可检测到荧光信号；

29、3、该方法与其他遗传分型技术相比，操作简单，2-3小时可以完成多例检测，具有灵敏度高、特异性好、快速、高通量检测等优点，且荧光标记探针可以在不同位点使用不同的荧光基团，可实现多重检测，通过直接探测pcr过程中荧光信号获得检测结果，基因分型清晰，不需要pcr后处理或电泳检测，可实现真正的闭管操作。