一种表达抗TNF-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌及其制备方法和应用。

背景技术：

1、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，tnf-α)作为研究深入的细胞因子之一，有大量证据表明，tnf-α不仅参与免疫反应，而且在细胞凋亡、细胞增殖、血管生成以及细胞通讯中发挥重要作用。在研究初期，被认为是一种有效的抗肿瘤细胞因子，在局部给予高剂量的tnf-α会诱导肿瘤细胞凋亡，然而，非持续性的局部注射会造成肿瘤复发而失去治疗效果，并且肿瘤组织分泌的低水平的tnf-α可诱导肿瘤血管生成、肿瘤细胞增殖以及促肿瘤免疫微环境的形成从而促进肿瘤进展。因此tnf-α是否可以作为抗肿瘤靶点是一个亟待探讨的问题。研究表明，tnf-α拮抗剂依那西普可显著减少结肠癌小鼠的肿瘤的数量和大小，并减少中性粒细胞和巨噬细胞对结肠的渗透。而临床实验表明，30例卵巢癌患者皮下注射tnf-α拮抗剂依那西普，部分患者出现皮疹、瘙痒、疼痛、注射部位肿胀、乏力、贫血等不良反应，且疗效不佳，仅五分之一患者病情稳定时间延长。在另一项临床研究中，肾癌患者接受了不同剂量的tnf-α拮抗剂英夫利昔单抗治疗，大多数患者都表现出不同程度的1级(潮红、粘膜炎、疲劳、头痛、肌肉痛、周围水肿和贫血)和2级(感染和贫血)毒性，16％的患者部分缓解，16％的患者病情稳定。如上所述，tnf-α拮抗剂具有有限的抗肿瘤效果且结果并不令人满意，主要是由于亟待提高的疗效以及重复给药会导致的副作用和高昂的成本限制了其在肿瘤治疗领域的应用。因此，tnf-α拮抗剂的肿瘤靶向给药是该领域的一个难题。

2、tnf-α拮抗剂作为一种治疗炎症性疾病的成功药物，广泛应用于临床，然而由于其半衰期短和肿瘤病灶靶向差导致的重复给药和脱靶效应，其在肿瘤治疗中的应用受到限制。因此，一种高效、高肿瘤靶向性的tnf-α抑制剂递送系统亟待开发。为解决该问题，本发明证明了tnf-α可作为抗肿瘤靶点被应用并公布了一种基于减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009疗法的tnf-α纳米抗体递送系统。tnf-α纳米抗体在原核生物表达时经常会以无活性的包涵体形式存在。vnp20009是puri基因和msbb基因缺失的转基因鼠伤寒沙门氏菌兼性厌氧菌，在体内具有肿瘤靶向性和遗传稳定性，肿瘤的细菌滴度比其他器官高数千倍，并且转移性黑色素瘤患者静脉注射vnp是安全的。

3、目前，缺乏一种适于在细菌中制备的有生物活性的tnf-α纳米抗体及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于为了解决现有技术中的问题，而提供了一种表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌及其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用，可抑制皮下黑色素移植瘤进展、延长黑色素瘤荷瘤小鼠生存时间、促进肿瘤坏死区域增加、降低肿瘤组织血管分布，采用技术方案如下：

2、为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌，所述的表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌可靶向定植于黑色素瘤核心区域内并持续分泌抗tnf-α纳米抗体；分泌表达有生物活性的抗tnf-α纳米抗体的表达质粒包含j23100组成型启动子和pelb胞外蛋白分泌信号肽以及带有flag标签蛋白的tnf-α纳米抗体的基因，抗tnf-α纳米抗体的表达质粒的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明的表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌制备的表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌菌剂。

4、进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：

5、(a)所述的分泌表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌的发酵液；

6、(b)所得的分泌表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌细胞的超声裂解上清；

7、(c)所得的分泌表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌细胞的超声裂解沉淀。

8、本发明所述的分泌表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌的制备方法，包括如下步骤：

9、(1)pcr或者合成tnf-α纳米抗体基因；

10、(2)tnf-α纳米抗体表达质粒的构建，其中包括如下的三步：设计同源重组引物；pcr或者合成获得tnf-α纳米抗体基因片段；同源重组后的连接产化转至大肠杆菌dh5α的化学感受态细胞中；

11、(3)构建分泌表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌：从大肠杆菌中提取构建成功的tnf-α纳米抗体表达质粒并通过电转化方法转化至减毒伤寒沙门氏菌vnp20009，获得分泌表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌。

12、目的片段的获得：本发明的一种分泌表达抗tnf-α纳米抗体的表达质粒是在pth01基础上加入其他元件改造获得的，合成引物通过聚合酶链式反应扩增获得质粒骨架，通过1％琼脂糖凝胶电泳胶回收目的片段；

13、通过合成引物进行聚合酶链式反应扩增获得tnf-α纳米抗体的目的片段，通过1％琼脂糖凝胶电泳胶回收目的片段，通过同源重组将目的片段连接至质粒载体上；

14、扩增得到j23100组成型启动子、flag标签蛋白以及pelb蛋白分泌信号肽，通过1％琼脂糖凝胶电泳胶回收目的片段，同源重组将目的片段连接至质粒载体上；

15、质粒化转：将10μl连接后产物化学转化至大肠杆菌dh5α化学感受态细胞中，转化条件为：冰上放置20min，42℃热击60s，冰置2min，加入900μl无抗性lb液体培养基，37℃震荡培养45min，5000rpm离心3min去除上清，加入100μl无抗性lb液体培养基混匀，涂布在带有卡那霉素的抗性平板上，37℃培养箱静置过夜；挑取四个单克隆菌落至1ml含有卡那霉素的lb中，37℃220rpm震荡培养12小时，通过质粒小提试剂盒获得重组质粒，使用验证引物通过聚合酶链式反应扩增获取验证阳性条带，送测序检测阳性条带碱基序列，比对后获得正确序列的重组质粒；

16、质粒电转：制备野生型vnp感受态细胞：活化后的vnp接种至10ml lb中，37℃摇床培养至od值为0.2-0.6，5000rpm，4℃离心5min收集菌体，10ml的10％甘油洗涤菌体3次，5000rpm，4℃离心5min收集菌体，用100μl 10％甘油重悬，分装50μl/管，用于电转；

17、通过电穿孔方法将上述的阳性质粒电转至vnp感受态中：在所有操作均在无菌条件下进行，在电转感受态加入1μg阳性质粒，并转移至2mm的电转杯，电转条件为：电压1800-2500v，电阻400-500ω，电容25μf，放电时间为5ms；将电转产物涂布于平板上，37℃培养箱静置过夜，挑取菌落进行测序验证。

18、进一步地，其质粒可稳定遗传。

19、本发明所述的分泌表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：分泌表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌可抑制皮下黑色素移植瘤进展、延长黑色素瘤荷瘤小鼠生存时间、促进肿瘤组织坏死区域增加。

20、进一步地，可制备成常规制剂形式，所述的制剂形式为口服、注射或静脉货喷剂中的任意一种。

21、进一步地，给药方式为单次给药。

22、有益效果：本发明提供了一种高肿瘤靶向性的、安全的、方便的、安全的、低廉的、全新的抗tnf-α纳米抗体的递送方式，即使用肿瘤特异性靶向的减毒沙门氏菌在肿瘤区域持续分泌抗tnf-α纳米抗体，可造成肿瘤区域的大面积坏死，因此表现出良好的肿瘤治疗前景。

23、与现有技术相比，本发明具有如下优点：

24、(1)尽管在vnp20009抗肿瘤研究时，发现tnf-α的水平与vnp20009抗肿瘤紧密正相关；但是本发明却明确证明tnf-α是有效的抗肿瘤靶点，阻断tnf-α能够产生抗肿瘤疗效；

25、(2)本发明首次使用减毒沙门氏菌vnp20009荷载抗tnf-α纳米抗体的表达质粒，即分泌表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌，其与野生型vnp相比有相似的肿瘤中定植率；本发明构建了可定植于肿瘤核心区域稳定持续地分泌抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌菌株，该菌株展示出了抗肿瘤治疗的潜力；

26、(3)本发明所述的分泌表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌可促进肿瘤组织的大面积坏死从而有良好的抗肿瘤能力，显示出较好的治疗前景；

27、(4)本发明所述的分泌表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌可降低肿瘤组织的tnf-α表达，并有效降低肿瘤组织血管分布，增大肿瘤组织乏氧面积，减少肿瘤组织营养输送从而促进肿瘤凋亡、缓解肿瘤进展；

28、(5)本发明所述的分泌表达抗tnf-α纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌可在肿瘤区域稳定的持续分泌抗tnf-α纳米抗体，可实现单剂给药就有良好的治疗能力，提供了一种实现了既便捷又低廉的向肿瘤环境递送纳米抗体的方法。