一种三氯生半抗原及其制备方法和应用与流程

本发明属于食品中内分泌干扰素净化、检测领域，涉及一种三氯生半抗原和抗原及其制备方法和应用。

背景技术：

1、内分泌干扰物（environmental endocrine disrupting chemicals，edcs），是一种在环境中存在的干扰人或动物内分泌系统的外源性化学物质，多数通过食物链进入生物体内，引起生物体自身荷尔蒙被干扰，在血液中循环、脂肪中积累，从而导致生物体正常的生殖、发育、免疫、行为活动等生理系统异常。三氯生（triclosan，tcs）是内分泌干扰物的一种，其作为高效广谱抗菌剂被广泛添加于个人护理品及日化产品中，可通过皮肤接触、口腔黏膜吸收等途径进入人体内。tcs能够降低孕期大鼠的甲状腺激素水平，且能够引起人体肝细胞的dna损伤，存在一定的遗传毒性。因此，tcs的人体暴露水平引起了学界的广泛关注。

2、对食物中的三氯生的残留水平进行准确测定是非常必要的。三氯生目前的检测方法主要有气相色谱法和气-质联用法、液相色谱法和液-质联用法等。样品前处理方法主要包括液液萃取、固相萃取、基质固相分散萃取和加速溶剂萃取等。这些方法存在选择性差、有机溶剂使用量大、操作复杂和不同基质间重现性差等缺点，而且操作繁琐、仪器昂贵。免疫化学分析法在抗原抗体的定性定量方面具有独特的优势，其操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大，弥补了理化分析的不足。

3、影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分子物质残留快速检测技术的最基础、最关键的步骤。

4、现有技术报道了不同化学结构的三氯生半抗原用于制备人工抗原，进而用于各种复杂基质，特别是食品中三氯生的检测。cn105085204a公开了一种三氯生半抗原化合物，其结构如下：

5、。

6、cn109956848a公开的三氯生半抗原化合物，其结构如下：

7、。

8、cn110286240a公开的三氯生半抗原化合物，其结构如下：

9、。

10、上述专利公开了不同结构的三氯生半抗原，但存在灵敏度和食品基质耐受性不足的问题。因此，为满足食品样本中痕量三氯生的检测需求，还需要研发一种基质耐受性和灵敏度更优的三氯生半抗原化合物用于复杂基质中的检测。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供一种三氯生半抗原及其制备方法和应用。

2、本发明第一个目的是提供一种三氯生半抗原，其结构如式i所示：

3、式i。

4、本发明第二个目的是提供式i所述三氯生半抗原的制备方法，包括如下步骤：

5、(s1)三氯生和4'-溴甲基联苯-2-羧酸甲酯在氢化钠存在下反应制备得到中间体式(ii)化合物；

6、(s2)式(ii)化合物依次经过水解、中和得到式(i)化合物。

7、上述三氯生半抗原的制备方法，其合成路线如下：

8、。

9、进一步地，步骤(s1)的反应条件是：50-70℃反应5-10h，三氯生和4'-溴甲基联苯-2-羧酸甲酯的摩尔比为1-3：1，氢化钠用量是三氯生质量的5-10wt%；反应溶剂为dmf、dmso中至少一种，其体积用量和三氯生的比例为1ml：30-50mg；反应结束后，降温至4-8 ℃，水淬灭反应，萃取，干燥，过滤，减压浓缩，硅胶层析柱提纯得到中间体(ii)。更进一步地，硅胶层析柱提纯是以乙酸乙酯上样，石油醚：乙酸乙酯=20-50:1洗脱，产物减压浓缩的油状产物，为中间体(ii)化合物。

10、进一步地，步骤(s2)中，所述水解是在c1-3醇和碱存在下进行，所述c1-3醇选自甲醇、乙醇、丙醇中的至少一种，所述碱选自naoh、koh中至少一种，水解反应条件是40-50℃至水解完全；中和是用0.5-2m hcl溶液调节ph为3-5，析出固体，过滤洗涤，干燥，得到产物式(i)所示化合物。

11、本发明第三个目的是提供一种三氯生抗原，为所述式(i)化合物和载体蛋白偶联得到。

12、进一步地，所述载体蛋白选自牛甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白和卵清蛋白中的至少一种。优选为牛血清白蛋白（bsa）或卵清蛋白（ova）。

13、其中，所述三氯生半抗原（式i）与所述载体蛋白偶联的摩尔比为10-15:1，优选为11-13:1。

14、在本发明一个具体实施方式中，所述三氯生抗原通过包括以下步骤的制备方法制得：

15、（1）将式(i)所述三氯生半抗原溶解于二甲基甲酰胺（dmf）中，然后加入羧基活化剂活化，20-25 ℃磁力搅拌反应2-3 h，得到溶液a；

16、所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）的复配。进一步对，式(i)所述三氯生半抗原、二甲基甲酰胺（dmf）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）、n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）的配比为25-35 mg：1.5-2 ml：21.5-25 mg：13-15 mg。

17、（2）将载体蛋白置于0.1 -0.2 m碳酸氢钠缓冲液中，搅拌充分溶解，得到溶液b；所述载体蛋白与碳酸氢钠缓冲液的配比为33.6-50 mg：3.5 ml；

18、优选地，当载体蛋白为牛血清白蛋白（bsa），则牛血清白蛋白（bsa）与碳酸氢钠缓冲液的配比为45-50 mg：3.5 ml；当载体蛋白为卵清蛋白（ova），则所述卵清蛋白（ova）与碳酸缓冲液的配比为33.6-35mg：3.5 ml。

19、（3）在0-4 ℃条件下，500-1000 rpm搅拌下，将溶液a 逐滴加入到所述溶液b中，500-1000 rpm搅拌反应24 h，得到溶液iii；

20、（4）用磷酸盐缓冲液，于4-10 ℃对所述溶液iii搅拌透析3-5天，得到所述三氯生抗原。

21、优选地，磷酸盐缓冲液的ph 为7-7.5，比如7.1、7.2、7.3或者7.4。

22、本发明第四个目的是提供一种三氯生抗体，是由上述三氯生抗原免疫动物得到。

23、进一步地，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体或抗血清

24、本发明第五个目的是提供上述式(i)所示的三氯生半抗原的任一如下用途：

25、(i)在制备三氯生抗原或者三氯生抗体中的用途；

26、(ii)在制备用于检测三氯生的设备中的用途；

27、(iii)在检测三氯生方面的用途。

28、所述检测三氯生的设备包括但不限于试剂盒、试剂管、免疫亲和柱、胶体金检测卡。

29、本发明第六个目的是提供一种检测三氯生的方法，使用上述三氯生抗体。

30、进一步地，所述检测方法包括免疫分析方法、生物传感方法、表面增强拉曼散射；更进一步地，所述免疫分析方法包括免疫亲和柱层析法、酶联免疫分析法、胶体金免疫层析法、化学发光免疫分析法、悬浮陈列法。

31、更进一步地，所述检测方法包括与超高效液相色谱、质谱任意一种或者两种联用。

32、本发明所提供的三氯生半抗原，以及所述三氯生抗原，合成方法简单、纯度高、产率高，对于三氯生抗体的制备，以及三氯生药物残留检测具有重大价值。