一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物探针组、试剂盒及检测方法

本发明属于及生物检测领域，特别涉及一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物探针组、试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、猪血凝性脑脊髓炎是由猪血凝性脑脊髓炎病毒(phev，porcinehemagglutinating encephalomyelitis virus)引起仔猪的一种急性、高度接触性传染病。phev是猪的神经和消化疾病的病原体，是首批被鉴定和分离出的猪冠状病毒之一，也是目前已知的唯一一种对猪产生影响的的嗜神经病毒。临床上主要感染3周龄以内的仔猪，表现为呕吐和划水样神经症状，病理学观察典型病变可见不同程度的脑膜出血、脑髓质有出血点，死亡率高达20-100％。因此，亟需建立针对猪血凝性脑脊髓炎病毒的检验检测方法。

2、目前，已报道的用于检测phev的方法有：免疫组织化学(ihc)试验方法、血凝/血凝抑制(ha/hi)试验方法、酶联免疫吸附试验快速免疫层析试条试验方法、包括病毒分离、病毒中和试验，以及能够从感染组织中检测特异性cov rna序列的分子工具，如巢式聚合酶链反应(nest pcr)、逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)和lamp方法。其中，其中，在现有的恒温核酸体外扩增方法中，环介导基因恒温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification，lamp)是一种相对比较成熟的新技术。lamp扩增方法的核心是使用链置换型dna聚合酶，当dna双链在65℃处于动平衡状态时，反应中的引物可通过类似于滚环复制的链替换反应，在同一条链上产生互补序列，周而复始形成大小不一的扩增产物。lamp扩增方法的特点是需使用4-6条引物，在一个蛋白的作用下，并在65℃的恒温条件下进行dna扩增反应。其反应灵敏度高于巢式pcr，并且特异性高。若使用荧光染料，还可以直接用肉眼观察到反应的扩增产物。但lamp扩增方法存在以下缺点：(1)lamp扩增方法使用的引物较复杂,必须用特殊的软件设计4-6个引物，设计难度大，易造成扩增产物引物二聚体过多的缺点；(2)lamp扩增方法易发生非特异性扩增，由于其同一反应中引物长度相对较短且数量相对较多，所以易造成引物的错配率增加，从而造成假阳性反应的缺点；(3)lamp扩增方法得到的扩增产物是一些大小不等的片段，无法直接克隆和测序，只能用于判定目的基因是否存在，这也是lamp方法最大的局限性；(4)因为引物数量较多，lamp扩增方法只能单纯扩增反应，不能进行双重扩增核酸鉴别诊断同一病原的不同基因型。进而限制了其大规模的推广应用。上述其他几种检测方法也费时费力，需要实验室程序或特殊设备，不适合现场检查，而且现有的检测策略也不能满足phev暴发后应急处理的需要，从而限制了其在兽医临床诊断中的应用。因此，建立一种灵敏、特异、简便的检测方法对快速检测和监测phev感染和传播至关重要。

3、重组酶聚合酶扩增技术(rpa，recombinase polymerase amplification)，是一种新的核酸分子快速恒温扩增技术，被称为是可以替代pcr的核酸检测技术，其工作原理主要包括：在37℃-42℃恒温下，该重组酶可与引物dna紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板dna上搜索到与之完全互补的序列时，在单链dna结合蛋白(single-stranded dnabinding，ssb)的帮助下，使模板dna解链，并在dna聚合酶的作用下，形成新的dna互补链；同时反应产物也是以指数级增长，通常在15分钟内即能得到可以实时检出。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用。

4、鉴于此，本发明提供了一种将rpa技术与荧光标记技术联用建立一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的荧光rt-rpa(real-time quantitative rt-rpa，实时荧光重组酶聚合酶扩增技术)检测方法。

技术实现思路

1、针对背景技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供了一种种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物探针组、试剂盒及检测方法。本发明检测方法能够快速检出猪血凝性脑脊髓炎病毒核酸，且敏感性强以及特异性高。

2、为了实现上述目的，本发明技术方案如下：

3、本发明的第一方面提供了一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的引物探针组，包括：针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的第一方向引物phev1brpaf123a、针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的中间探针phevpg123、以及针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的第二方向引物phevns2rpar123c，其中，

4、所述针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的第一方向引物phev1brpaf123a的序列如seq id no.1所示，

5、所述针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的第二方向引物的phevns2rpar123c的序列如seq id no.2所示，

6、所述针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的中间探针phevpg123的序列如seq id no.3所示，其中，i6fam dt表示fam分子，fam表示荧光分子fam，ibhq1dt表示bhq1分子，idsp表示thf分子，thf代表四氢呋喃分子。

7、优选地，所述针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的第一方向引物phev1brpaf123a与针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的中间探针phevpg123针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的同一个方向，且针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的中间探针phevpg123位于针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的第一方向引物phev1brpaf123a与针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的第二方向引物phevns2rpar123c之间。

8、优选地，所述针对猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的中间探针phevpg123的中游连接有第一标记分子和第二标记分子、中间包含能够被具有dna损伤修复活性的酶识别并切除的人工碱基类似物以及下游连接有防止聚合反应的保护标签。

9、优选地，所述第一标记分子为荧光分子fam，所述第二标记分子为bhq1，所述保护标签为c3-spacer；所述被具有dna损伤修复活性的酶识别并切除的人工碱基类似物为四氢呋喃(thf)。

10、本发明的第二方面提供了一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒orf1b、ns2基因的试剂盒，包括上述引物探针组。

11、优选地，所述试剂盒还包括nfo酶、重组酶uvsx、辅助蛋白uvsy、gp 32蛋白、bsudna聚合酶、dntps、二硫苏糖醇、三磷酸腺苷、三甲基甘氨酸、聚乙二醇20000、肌酸激酶、磷酸激酶、醋酸钾、醋酸镁。

12、本发明的第三方面提供了一种猪血凝性脑脊髓炎病毒的检测方法，用于非诊断目的的，包括以下步骤：

13、s1、从待测样品中提取核酸；

14、s2、将待测样本中提取的核酸加入rpa反应体系中，进行rpa反应；

15、s3、使用恒温实时荧光扩增仪将步骤s2中所得扩增产物进行显示。

16、优选地，所述步骤s2中，rpa反应体系包括：100ng/μl重组酶uvsx、50ng/μl辅助蛋白uvsy、100ng/μlgp 32蛋白、25ng/μl bsu dna聚合酶；0.5mm dntps、1mm二硫苏糖醇、3mm三磷酸腺苷、100mm三甲基甘氨酸、5％聚乙二醇20000、100ng/μl肌酸激酶、20mm磷酸激酶、80mm醋酸钾、50pm phev1brpaf123a、50pm phevns2rpar123c、10pm phevpg123、10unitsnfo酶、100mmol/l醋酸镁；

17、所述反应程序为：39℃，扩增15-30min。

18、与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

19、本发明以phev orf1b、ns2保守序列设计rpa引物和探针，再以合成重组质粒pet28b-ms2-phev为模板，成功建立了phev的rt-rpa方法。相较于传统rt-pcr方法，本发明检测方法不仅节省了时间成本、简化了操作、更为高效，而且表现出良好的敏感性和特异性，最低可达到检测3.44×101拷贝的pet28b-ms2-phev质粒。

20、本发明通过将rpa扩增与荧光探针检测技术相结合使检测结果可直接实时判读，从而实现猪血凝性脑脊髓炎病毒的分子检测现场化、快速化，省去了原有的pcr或lamp扩增产物需要经过凝胶电泳后进行结果的判定的过程，因此在兽医基础检测方向具有良好的应用前景，对于保障养猪业的健康发展及食品安全具有重要意义。