一种MICU1基因条件性敲除小鼠的构建方法

本发明属于基因编辑，具体涉及一种micu1基因条件性敲除小鼠的构建方法。

背景技术：

1、基因打靶通常是指用含已知序列的dna片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源dna导入技术，建立在胚胎干细胞(embryonic stem cell，es细胞)与同源重组技术基础之上的基因打靶技术(gene targeting)是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段；通过对生物遗传信息的定向修饰，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而研究基因的功能，阐明生物体的遗传进化，疾病发生的分子机制，提供相关的疾病治疗药物、评价模型及新型预防、治疗疫苗等，是后基因组时代基因功能研究的重要技术手段；原理首先获得es细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶es细胞，通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的es细胞引入受体胚胎内，经过遗传修饰的es细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传，获得的带有特定修饰的突变动物提供研究者一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能，目前，在es细胞进行同源重组已经成为一种对小鼠染色体组上任意位点进行遗传修饰的常规技术，通过基因打靶获得的突变小鼠已经超过千种，并正以每年数百种的速度增加，通过对这些突变小鼠的表型分析，许多与人类疾病相关的新基因的功能已得到阐明，并直接导致了现代生物学研究各个领域中许多突破性的进展。

2、在现有技术中，传统的基因编辑技术具有操作繁琐、成本高以及效率低下的缺点，本发明通过采用es打靶基因编辑技术，改善基因编辑技术中操作繁琐、成本高以及效率低下的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种micu1基因条件性敲除小鼠的构建方法，旨在解决现有技术中基因编辑技术具有操作繁琐、成本高以及效率低下的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种micu1基因条件性敲除小鼠的构建方法，包括如下步骤：

4、s1、打靶载体的构建：选择位于小鼠10号染色体上的micu1基因，设计靶向等位基因，鉴定打靶载体；

5、s2、打靶载体电转至es细胞：利用noti限制性内切酶将打靶载体线性化，然后用苯酚/氯仿将其提取和并利用乙醇沉淀，按照电穿孔标准程序将线性化的载体转染到c57bl/6nes细胞；

6、s3、筛选阳性克隆：利用g418筛选，转染的es细胞置于96孔培养板中培养24小时后，加入g418继续培养，进行抗性筛选，g418的浓度为200μg/ml，筛选pcr，对筛选的耐药es细胞再次进行pcr筛选；分析southern印迹，利用southern印迹对上述经过pcr筛选的六个阳性克隆进一步分析表征，在southern分析中，neo探针检测到来自靶向等位基因的以下dna片段，约11.51kb(用kpni酶切)和约10.22kb(用bsteii酶切)，进一步证实六个克隆均是含有靶向等位基因的正确克隆，用于植入代孕鼠输卵管；

7、s4、f1代micu1条件性敲除小鼠：将靶向es细胞克隆注射入cd-1小鼠胚胎，移植到代孕的c57bl/6母鼠体内，并对受体母鼠进行妊娠检查，通过毛色鉴定新生小鼠，通过与c57bl/6雌性繁殖和对后代进行基因分型来证实其种系传播。从克隆n-1h3中产生了四只雄性和两只雌性杂合靶向小鼠，提取鼠尾dna后，并以此为模板，利用pcr引物进行pcr反应，通过琼脂糖凝胶电泳分离pcr产物，观察条带位置，判断新生小鼠是否含有靶向等位基因。

8、作为本发明一种优选的方案，所述步骤s1中，选择micu1基因为(ncbi参考序列：nm_001291442；ensembl:ensmusg0000020111)，位于小鼠10号染色体上，其中，序列编码为ensmust0000020311的转录本总共有14个外显子，atg起始密码子在外显子2，tag终止密码子在第14外显子；打靶载体拟选择外显子4作为条件敲除区(conditional knockoutregion，cko区)，在靶向载体中，neo盒的两侧将有自删除锚定位点(self-deletionanchor，sda),dta将用于负性选择。

9、作为本发明一种优选的方案，所述步骤s1中，靶向等位基因的设计是为了构建靶向载体，使用bac(bacterial artificial chromosome，细菌人工染色体)rp23-146p8和rp24-263i7作为模板，利用高保真taq dna聚合酶从bac克隆中扩增含有同源臂(ha)的小鼠基因组片段，并将其与重组位点和选择标记一起顺序组装到靶向载体中。

10、作为本发明一种优选的方案，所述步骤s1中，打靶载体的鉴定是在打靶载体构建好后，通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，具体鉴定方法为：利用多种限制性内切酶对构建的打靶载体进行酶切，会形成多条dna片段，利用琼脂糖凝胶电泳将上述酶切产物分离，并根据片段的大小来确定载体是否构建成功，构建成功的打靶载体，经过酶切后的片段大小为(单位：kb)，(1.fspi酶：4.6/3.2/2.6/1.5/1.2；2.xmni酶:4.8/3.3/2.7/1.8/0.6；3.drdi:

11、5.1/3.7/2.3/2.0；4.ncoi酶:5.5/4.2/1.5/1.0/0.6/0.3；5.apali:

12、7.2/3.4/1.2/1.0/0.2；6.noti酶:13.1)。

13、作为本发明一种优选的方案，所述步骤s2中，按照电穿孔标准程序将线性化的载体转染到c57bl/6n es细胞。

14、作为本发明一种优选的方案，所述步骤s3中，针对突变等位基因共设计了三对pcr引物，分别针对同源臂(3'arm)、loxp和neo特征序列。

15、作为本发明一种优选的方案，所述步骤s4中，判断新生小鼠是否含有靶向等位基因，具体为：野生：353bp，纯合：461bp；杂合：461bp/353bp，经过pcr及琼脂糖凝胶电泳鉴定后，最终获得f1代micu1条件性敲除小鼠。

16、作为本发明一种优选的方案，所述步骤s4中，pcr引物为“primers for neodeletion pcr:neo-del-f(f1):5’-gaactagccaagataaacagcgtg-3，neo-del-r(r1):5’-gtgtgtttcctgtggtggtctg-3’”。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

18、1、本发明中，通过使用本方法构建micu1条件性敲除小鼠，与不同类型的cre工具鼠交配获得某种组织或某类细胞特异性敲除的基因编辑小鼠，为明确线粒体钙调控关键分子micu1的作用奠定基础，相较于传统基因编辑技术具有操作便捷、低成本、高效率等优点，crispr/cas9系统具有设计灵活、成本低、操作简单、准确性高、可多位点同时打靶等优势。

19、2、本发明中，利用多种限制性内切酶对构建的打靶载体进行酶切，会形成多条dna片段，利用琼脂糖凝胶电泳将上述酶切产物分离，并根据片段的大小来确定载体是否构建成功。

20、3、本发明中，判断新生小鼠是否含有靶向等位基因，具体为：野生：353bp，纯合：461bp；杂合：461bp/353bp，经过pcr及琼脂糖凝胶电泳鉴定后，最终获得f1代micu1条件性敲除小鼠。