一种复合蛋白酶交联酶聚体制备枸杞蛋白多肽的方法

本发明涉及食品深加工领域，具体涉及一种复合蛋白酶交联酶聚集体水解枸杞蛋白制备枸杞多肽的方法。

背景技术：

1、枸杞为茄科植物多年生落叶灌木的干燥成熟果实。在朝鲜、日本、欧洲大部分地区均有种植，中国主要分布在宁夏、甘肃、新疆、青海、陕西、山西及河北等地。《中国药典》注明，仅有宁夏枸杞入中药，因此中国宁夏枸杞子最为盛名。

2、枸杞还具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、抗福射损伤、降血脂、降血糖、降血压、保肝、健脑、补肾、排毒、养颜和保护生殖系统等多项功能。现代中药学研究表明：枸杞的主要有效成份有多糖、色素、黄酮以及蛋白质、甜菜碱、氨基酸、类胡萝卜素等。其中，枸杞多糖是枸杞主要活性成份之一，有多种药理作用和生物活性，比如能提高人体免疫力，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤及降血糖、降血脂等作用。此外，枸杞蛋白也是枸杞的重要活性物质，枸杞蛋白含有人体必须的八种氨基酸，其氨基酸组成较为平衡。枸杞蛋白对自发性高血压有很好的疗效，同时具有很好的清除自由基的能力，能够达到抗衰老作用。而且，与枸杞蛋白相比，枸杞蛋白多肽不仅更易被人体吸收，同时具有多种生理功能活性，因此，如何从枸杞中高效地制备枸杞蛋白多肽成为研究的热点。

3、小分子肽是一种非常重要的生物活性物质，其在体内的吸收速度要快于氨基酸。其中抗氧化肽既能清除自由基又能防止机体受到外界的刺激，还能防止细胞膜脂质、蛋白质dna受到活性氧的损害，在心脑血管疾病、肿瘤和阿尔茨海默病等疾病的防治中具有重要的意义。目前小分子肽常用的制备方法是利用蛋白酶水解蛋白质，但由于游离蛋白酶稳定性差、反应过程难以控制,不利于工艺自动化、难以回收重复使用等缺点限制了其在蛋白多肽制备中进一步应用。例如，中国专利文献cn106360618a公开了一种热反应型枸杞风味反应物及其制备方法，利用游离蛋白酶水解枸杞蛋白，但是提取过程中需要高温，导致酶失活，而且制备过程较复杂；中国专利文献cn111972661a公开一种羊胎盘枸杞产品的制备方法及产品，但也需要用加热加压，导致酶失活，成本较高。

4、综上所述，目前游离蛋白酶制备枸杞蛋白多肽的技术普遍存在着操作复杂、酶易失活、效率低、成本高等各种问题。因此，利用固定化蛋白酶水解制备枸杞蛋白多肽具有广阔的应用前景和重要的现实意义，本领域急需提出一种绿色环保且高效的蛋白酶酶解制备枸杞蛋白多肽的方法。

5、酶固定化技术具有可提高酶的稳定性、使酶能够回收重复使用、提高生物催化过程的经济性等优点，为克服游离酶的缺点提供了方案。目前主要有两种不同的酶固定化方法，包括有载体固定化酶方法(吸附、包埋、交联和共价结合法)和无载体固定化酶方法(交联酶聚集体，cleas)。其中cleas技术是2000年由荷兰代尔夫特大学sheldon小组提出的一种新型无载体酶固定化方法。与有载体固定化酶相比，cleas具有明显优势：对酶要求纯度低、单位体积活性高、稳定性和特异性好、适用范围广泛等众多优点，因此，cleas受到国内外研究者的广泛关注。但是，利用基于cleas技术制备的固定化复合蛋白酶制备枸杞多肽的应用未见报道。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种复合蛋白酶交联酶聚集体水解枸杞蛋白制备枸杞多肽的方法，利用交联酶聚体技术制备出木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的复合蛋白酶交联酶聚体，利用所制备的复合蛋白酶交联酶聚体水解枸杞蛋白制备枸杞多肽。

2、本发明提供了一种复合蛋白酶交联酶聚体在制备枸杞蛋白多肽中的应用。

3、优选的是，所述复合蛋白酶交联酶聚体为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的复合蛋白酶交联酶聚体。

4、上述任一项优选的是，所述复合蛋白酶交联酶聚体中所述风味蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶活比为(1～3)：(1～3)。进一步优选的，所述风味蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶活比为1：1，1：2，2：1，1：3，3：1；更优选的是，风味蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶活比为3：1。

5、本发明提供了一种复合蛋白酶交联酶聚体的制备方法，包括以下步骤：

6、步骤1：将木瓜蛋白酶和风味蛋白酶溶于磷酸钠缓冲液；加入饱和硫酸铵，聚集沉淀；

7、步骤2：缓慢加入戊二醛，搅拌，使聚集体交联；

8、步骤3：离心，洗涤沉淀，获得木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的复合蛋白酶交联酶聚体。

9、所述复合蛋白酶交联酶聚体为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的复合蛋白酶交联酶聚体。

10、优选的是，制备得到的复合蛋白酶交联酶聚体用于上述任一项所述的复合蛋白酶交联酶聚体在制备枸杞蛋白多肽中的应用。

11、上述任一项优选的是，步骤1中，所述木瓜蛋白酶为0.1-0.5g，进一步优选为，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g。

12、上述任一项优选的是，步骤1中，所述风味蛋白酶为0.1-0.5g，进一步优选为，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g。

13、上述任一项优选的是，将木瓜蛋白酶和风味蛋白酶溶于50-100mm的磷酸钠缓冲液，进一步优选的是，所述磷酸钠缓冲液的浓度为50、60、70、80、90、100mm，进一步优选的是所述磷酸钠缓冲液的ph为5-9，进一步优选的是，所述磷酸钠缓冲液的ph为5、6、7、8、9；更为优选的是，将木瓜蛋白酶和风味蛋白酶溶于50-100mm ph7.5的磷酸钠缓冲液；更为优选的是，将木瓜蛋白酶和风味蛋白酶各0.1g溶于50mm ph 7.5的磷酸钠缓冲液中；

14、上述任一项优选的是，步骤1中，加入40％-80％的饱和硫酸铵，在4℃条件下搅拌，聚集沉淀。进一步优选的是，加入40％、50％、60％、70％、80％；最优选，加入60％的饱和硫酸铵，在4℃条件下搅拌，聚集沉淀。

15、上述任一项优选的是，步骤2中缓慢加入0-1.5％的戊二醛，在4℃搅拌20-80min，使聚集体交联。进一步优选的，所述戊二醛的体积分数为0-1.5％，0.5％，1％，1.5％。更优选为0.5％；优选的，在4℃搅拌20-80min，更优选为50min。

16、上述任一项优选的是，步骤3中，在6000-10000rpm离心10-30min，沉淀用50mmph7.5的磷酸钠缓冲液洗涤三次，最后将沉淀用50mm ph 7.5的磷酸钠缓冲液在4℃下储存。优选的，离心条件为6000-10000rpm、6000rpm、8000rpm、10000rpm；离心时间10、20、30min，更优选为10000rpm离心10min。

17、本发明还提供了一种复合蛋白酶交联酶聚体制备枸杞蛋白多肽的方法，利用木瓜蛋白酶和风味蛋白酶按照权利要求2-6任一项所述复合蛋白酶交联酶聚体的制备方法进行复合蛋白酶交联酶聚体的制备；再利用制备好的复合蛋白酶交联酶聚体水解枸杞蛋白，得到枸杞多肽；所述复合蛋白酶交联酶聚体水解枸杞蛋白包括以下步骤：

18、步骤3：将枸杞蛋白溶液分别调至各蛋白酶的最适反应ph和最适反应温度；

19、步骤4：加入所述复合蛋白酶交联酶聚体；

20、步骤5：蛋白酶灭活。

21、所述复合蛋白酶交联酶聚体为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的复合蛋白酶交联酶聚体。

22、优选的是，所述复合蛋白酶交联酶聚体中所述风味蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶活比为(1～3)：(1～3)。进一步优选的，所述风味蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶活比为1：1，1：2，2：1，1：3，3：1；进一步的，所述风味蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶活比为优选为3：1。

23、上述任一项优选的是，步骤3中，所述各蛋白酶的最适反应ph为5-9；进一步优选的ph为5、6、7、8、9。

24、上述任一项优选的是，步骤3中，所述各蛋白酶最适反应温度(40-80)℃；进一步优选的温度为40、50、60、70、80℃。

25、本发明所述各蛋白酶是指本发明制备复合蛋白酶交联酶聚体的蛋白酶，包括风味蛋白酶与木瓜蛋白酶。优选的，所述最适反应ph为5-9，更优选为ph＝6。优选的，所述最适反应温度(40-80)℃，更优选为最适反应温度60℃。

26、上述任一项优选的是，步骤4中所述复合蛋白酶交联酶聚体的加酶浓度控制在2-14mg/ml。优选的，所述加酶浓度控制为2-14mg/ml，2、4、6、8、10、12、14mg/ml，更优选为10mg/ml。

27、上述任一项优选的是，步骤4中酶解时间60-140min。优选的，所述进行60-140min、60、80、100、120、140min的酶解，更优选为100min。

28、上述任一项优选的是，步骤5中进行20min沸水浴后可将蛋白酶灭活从而终止反应。

29、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

30、本发明提供一种复合蛋白酶交联酶聚集体水解枸杞蛋白制备枸杞多肽的方法，包括以下步骤：

31、(1)所述复合蛋白酶交联酶聚体制备的制备方法包括以下步骤：将木瓜蛋白酶和风味蛋白酶溶于50mm磷酸钠缓冲液(ph 7.5)中，加入40％-80％的饱和硫酸铵，在4℃条件下搅拌，聚集沉淀，然后再缓慢加入0-1.5％的戊二醛，在4℃搅拌20-80min，使聚集体交联。然后在6000-10000rpm离心10-30min。沉淀用50mm磷酸钠缓冲液(ph 7.5)洗涤三次，最后将沉淀用50mm磷酸钠缓冲液(ph 7.5)在4℃下储存。所述风味蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶活比为(1～3)：(1～3)，优选为3：1。

32、(2)利用步骤(1)得到的制备好的复合蛋白酶交联酶聚体水解枸杞蛋白，得到枸杞多肽。

33、进一步地，所述复合蛋白酶交联酶聚体制备的制备方法包括以下步骤：将木瓜蛋白酶和风味蛋白酶溶于50mm磷酸钠缓冲液(ph 7.5)中，加入40％-80％的饱和硫酸铵，在4℃条件下搅拌，聚集沉淀，然后再缓慢加入0-1.5％的戊二醛，在4℃搅拌20-80min，使聚集体交联。然后在6000-10000rpm离心10-30min。沉淀用50mm磷酸钠缓冲液(ph 7.5)洗涤三次，最后将沉淀用50mm磷酸钠缓冲液(ph 7.5)在4℃下储存。例如，加入饱和硫酸铵可以为40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％。加入饱和硫酸铵优选为55～65％，在此范围下的酶活更高，更适合制备交联酶聚集体。

34、进一步地，步骤(1)中，缓慢加入0-1.5％的戊二醛，在4℃搅拌20-80min。例如，戊二醛添加量可以为0％，0.1％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1.0％，1.1％，1.2％，1.3％，1.4％，1.5％，交联时间可以为20min，30min，40min，50min，60min，70min，80min。优选戊二醛添加量为0.1％-0.5％，优选交联时间为40～60min。更优选为在戊二醛添加量为0.5％下搅拌50min。

35、进一步地，步骤(2)中，将枸杞蛋白溶液分别调至各蛋白酶的最适反应ph(5-9)和最适反应温度(40-80)℃，分别将适量上述复合蛋白酶交联酶聚体加入其中，将加酶浓度控制在2-14mg/ml，在此条件下进行60-140min的酶解。进行20min沸水浴后可将蛋白酶灭活从而终止反应。例如，最适反应ph可以为5，6，7，8，9，最适反应温度可以为40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃。优选最适反应ph＝5-7，优选最适反应温度为50℃-70℃。更优选为最适反应ph＝6，更优选为最适反应温度为60℃。

36、进一步地，步骤(2)中，分别将适量上述复合蛋白酶交联酶聚体加入其中，将加酶浓度控制在2-14mg/ml，在此条件下进行60-140min的酶解。进行20min沸水浴后可将蛋白酶灭活从而终止反应。例如，加酶浓度可以为2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml，6mg/ml，7mg/ml，8mg/ml，9mg/ml，10mg/ml，11mg/ml，12mg/ml，13mg/ml，14mg/ml，酶解时间可以为60min，65min，70min，75min，80min，85min，90min，95min，100min，105min，110min，115min，120min，125min，130min，135min，140min。优选加酶浓度为8mg/ml-12mg/ml，优选酶解时间为80min-120min。更优选为加酶浓度为10mg/ml，更优选为酶解时间为100min。

37、本发明技术方案，具有如下优点：

38、1、游离蛋白酶稳定性差、难以回收重复利用，导致其使用成本高，限制了工业化应用。尽管有固定化蛋白酶的报道，但是，未见利用交联酶聚体技术固定化复合蛋白酶的报道。本发明利用cleas技术制备复合蛋白酶(木瓜蛋白酶和风味蛋白酶)交联酶聚集体，该复合蛋白酶交联酶聚体具有较高的稳定性、可回收重复使用，显著降低了蛋白酶的使用成本，为克服游离蛋白酶的缺点提供了方案。

39、2、尽管有利用蛋白酶水解枸杞蛋白制备枸杞多肽的报道，但是，未见利用复合蛋白酶交联酶聚体水解枸杞蛋白制备枸杞多肽。本发明利用所制备的复合蛋白酶交联酶聚体水解枸杞蛋白制备枸杞多肽。与单一蛋白酶相比，该方法不仅能够提高枸杞蛋白的水解效率，而且所制备的枸杞蛋白多肽具有良好的抗氧化性能。该方法具有效率高、低能耗、低成本、操作便利、新型绿色、无三废排放等优点。