利用铋基化合物增强聚合酶链式反应的方法及应用

本发明属于基因扩增，更具体地，本发明涉及一种利用铋基化合物增强聚合酶链式反应的方法及应用。

背景技术：

1、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)，简称pcr，用于放大特定的dna片段，其可作为生物体外的特殊dna复制。pcr技术是生物技术领域中最重要的生物技术(包括细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术)之一。

2、pcr由变性、退火、延伸三个基本的反应步骤构成。在一般的pcr技术中，利用dna在体外约95℃高温时变性会变成单链，低温(例如约在60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至dna聚合酶最适反应温度(约72℃左右)，dna聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5’-3’)的方向合成互补链。基于聚合酶制造的pcr仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

3、dna模板-引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。短时间内就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

4、具有高gc含量(例如>65％)的dna模板由于g和c碱基间的强氢键影响，比较难以扩增。富含gc的序列同时也涉及二级结构。因此，富含gc的序列可导致dna聚合酶沿模板扩增时发生停滞或滞后，干扰dna合成。为了扩增高gc含量的片段，双链模板必须解离，以便引物与模板结合，并使dna聚合酶能够读取到序列。为了减少强gc相互作用，本领域使用dmso等pcr添加剂或辅助溶剂来帮助dna变性。dmso减少二级结构的发生，并通过减弱非特异性引物结合的稳定性，提高反应的特异性。然而，dmso此类试剂带有一定的毒性，使用时应尽量控制其用量。

5、综上，尽管pcr已经是一种成熟的技术，但进一步进行pcr反应条件的优化仍是本领域的需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种利用铋基化合物增强聚合酶链式反应的方法及应用。

2、在本发明的第一方面，提供一种增强聚合酶链式反应的方法，所述方法包括：在聚合酶链式反应体系中，添加铋基化合物。

3、在一种或多种优选实施方式中，所述聚合酶链式反应体系为含有以下组分的缓冲液：dna模板、引物、dntps、dna聚合酶、甘油、dmso。

4、在一种或多种优选实施方式中，所述dna模板、引物、dntps、dna聚合酶、甘油、dmso为有效量的、适于所述聚合酶链式反应的进行。

5、在一种或多种优选实施方式中，所述dna模板为待测核酸样品或来自于待测核酸样品。

6、在一种或多种优选实施方式中，所述铋基化合物在反应体系中的浓度为0.001nm～5mm，如0.005nm，0.01nm，0.05nm，0.1nm，0.5nm，1nm，5nm，10nm，50nm，100nm，500nm，1um，5um，10um，50um，100um，500um，1mm，2mm。

7、在一种或多种优选实施方式中，所述铋基化合物包括：柠檬酸铋铵或次碳酸铋。

8、在一种或多种优选实施方式中，所述铋基化合物为柠檬酸铋铵，其在反应体系中的浓度为0.001nm～500um，如0.005nm，0.01nm，0.05nm，0.1nm，0.5nm，1nm，5nm，10nm，50nm，100nm，500nm，1um，5um，10um，50um，100um，200um。

9、在一种或多种优选实施方式中，所述铋基化合物为次碳酸铋，其在反应体系中的浓度为0.1nm～5mm，如0.2nm，0.5nm，1nm，5nm，10nm，50nm，100nm，500nm，1um，5um，10um，50um，100um，500um，1mm，2mm。

10、在一种或多种优选实施方式中，按照体积比，所述甘油在聚合酶链式反应体系中的浓度为1～20％；较佳地2～15％，如3％、4％、5％、6％、8％、10％、12％、14％。

11、在一种或多种优选实施方式中，所述甘油为低量的，按照体积比为2～7％，如3％、4％、5％、6％。

12、在一种或多种优选实施方式中，按照体积比，所述dmso在聚合酶链式反应体系中的浓度为1～15％；较佳地1.5～12％，如2％、3％、4％、5％、6％、8％、10％。

13、按照体积比，所述dmso为低量的，按照体积比为1.5～5％，如2％、3％、4％、5％。

14、在一种或多种优选实施方式中，所述聚合酶链式反应中，dna聚合酶为taq dna聚合酶。

15、在一种或多种优选实施方式中，所述taq dna聚合酶包括(但不限于)：ex taq，vazyme taq，bbi taq，neb taq，takara rtaq，genstar taq，toyobo rtaq。

16、在本发明的另一方面，提供前面任一所述的方法的应用，用于进行聚合酶链式反应，或用于分析待测样品(核酸样品)中目标dna的存在情况。

17、在一种或多种优选实施方式中，所述分析待测样品(核酸样品)中目标dna的存在情况为非诊断性的。

18、在本发明的另一方面，提供铋基化合物(如柠檬酸铋铵或次碳酸铋)的应用，用于增强聚合酶链式反应。

19、在一种或多种优选实施方式中，所述铋基化合物(如柠檬酸铋铵或次碳酸铋)通过对taq dna聚合酶的吸附，调节聚合酶在反应液中的活性，增强反应效率。

20、在一种或多种优选实施方式中，所述铋基化合物(如柠檬酸铋铵或次碳酸铋)通过促进产物解离，加速反应进程，增加目标产物产量。

21、在一种或多种优选实施方式中，所述聚合酶链式反应用于扩增的dna为高gc含量的dna；较佳地其gc含量高于55％(如gc含量为55～95％)；更佳地其gc含量高于60％(例如gc含量为或高于65％，70％，75％，80％，85％，90％)。

22、在本发明的另一方面，提供一种聚合酶链式反应的试剂盒，所述试剂盒中包括：铋基化合物，dntps，dna聚合酶，甘油，dmso。

23、在一种或多种优选实施方式中，所述dna模板、引物、dntps、dna聚合酶、甘油、dmso为有效量的、适于所述聚合酶链式反应的进行。

24、在一种或多种优选实施方式中，所述铋基化合物为柠檬酸铋铵，其在反应体系中的浓度为0.001nm～500um。

25、在一种或多种优选实施方式中，所述铋基化合物为次碳酸铋，其在反应体系中的浓度为0.1nm～5mm。

26、在一种或多种优选实施方式中，按照体积比，所述甘油在聚合酶链式反应体系中的浓度为1～20％；或，所述dmso在聚合酶链式反应体系中的浓度为1～15％。

27、更佳地，在一种或多种优选实施方式中，所述dna聚合酶为taq dna聚合酶。

28、在一种或多种优选实施方式中，所述taq dna聚合酶包括(但不限于)：ex taq，vazyme taq，bbi taq，neb taq，takara rtaq，genstar taq，toyobo rtaq。

29、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。