一种在CHO细胞中抗体高表达的载体及其应用的制作方法

本发明属于生物工程，具体涉及一种在cho细胞中抗体高表达的载体及其应用。

背景技术：

1、抗体的发展经历了从鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人源化抗体的阶段，目前所研发或生产的抗体以人源化和全人源化抗体为主。近年来，抗体药物制备技术不断更新迭代，从最初的单克隆抗体衍生出了新的技术平台，包括双特异性抗体、抗体偶联药物等。因此，抗体经历了从野生型单克隆抗体到重组抗体的转变，基因工程技术的发展使得这一转变得以成功实施，并产生一些优于野生型抗体的重组抗体。基因工程技术提供了操纵抗体基因的能力，使其可以产生所需的抗体框架、抗体结构，便于应用突变筛选技术获得高亲和力、高度人源化的抗体，可以易于操控抗体的adcc\cdc\adcp效应、半衰期或翻译后修饰等，并能允许加入标签和融合蛋白来协助抗体的纯化、检测及增加新的功能，例如，增加半衰期和增强抗肿瘤活性等。

2、抗体表达涉及质粒dna进入细胞、mrna转录、mrna翻译、抗体转运、抗体分泌等多个步骤，抗体具有复杂的结构及翻译后修饰机制，需要复杂的细胞器完成抗体的正确表达、翻译、折叠和加工。基因水平、细胞水平、细胞培养水平和分子水平等各方面条件优化对抗体的表达均有影响。

3、表达载体介导了抗体序列进入宿主及在宿主细胞中的高效表达，载体中很多元件直接或间接参与了目的序列的转录或翻译调控，如promoter、信号肽、enhancer、utr、poly(a)、wpre等，一些常规载体中不常使用的元件包括insulator、mars、ucoe、stars等对抗体的表达也有一定影响。表达载体的分子元件的优化对抗体的表达量及质量均有明显提升。

4、启动子是rna聚合酶识别、结合和开始转录的一段dna序列，一般位于结构基因5’端上游，它通过活化rna聚合酶，使之与模板dna的准确结合并起始转录，高效启动子的选择是保证重组蛋白高效表达的重要因素。启动子转录起始效率取决于tata框、enhancer、下游启动子元件(dpe)、转录因子ibb识别元件、intron等。用于哺乳动物细胞表达的常用启动子包括hcmv、ef-1α、sv40e、rsv、cag、ubc等。cmv是真核表达中常用的一个启动子，能启动目的基因高效表达，但由于转录沉默效应，cmv不能介导目的基因的长期持续性表达。ef-1α与cag启动子在常规肿瘤细胞中具有较强的起始目的基因表达的能力，且能介导目的基因长时间的稳定表达。研究发现，在cho细胞中，ef-1α表达gfp蛋白的活性强于hcmv-ie 200-300倍，cho细胞中可能存在抑制hcmv-ie启动子的机制，且不同细胞群中表达量也是可变的。不同启动子下，egfp表达能力分别为chef-1α>hef-1α>cmv>cag。

5、启动子起始dna的转录，3’端非编码区对转录终止具有重要作用。poly(a)信号是真核细胞mrna 3’的一段序列，对mrna的稳定性、翻译及转运具有重要作用。核心序列基序aauaaa是mrna 3’末端多聚腺苷酸化所必须的，其侧翼的辅助元件也参与了3’端切割、前信使rna(pre-mrna)的多聚腺苷酸化及促进下游转录终止。紧邻基因3’侧翼区域中的mrna 3’末端之后存在的富含gu的序列可以增强3’末端的形成，3’端切割位点的实际核苷酸也会影响腺苷酸化过程。

6、wpre是一段顺式作用的dna元件，参与了mrna的转录后调控，放于poly(a)信号之前可以显著增加mrna的翻译水平，并增强基因的表达。wpre也常见于病毒载体中，用于提升病毒包装的滴度。wpre由α，β，γ三部分组成，其中，α元件长80bp，只保留wpreα元件，其活性只有全长wpre的9％，去掉β或γ元件，其活性也远不如全长wpre，说明wpre的三个元件共同维持了其活性，且wpre转录后的调控能力取决于元件的数量。

7、抗体通过转运途径进行分泌，因此，抗体分泌的限速步骤在于通过信号肽转运至内质网的途径。信号肽位于目的蛋白的n端，包含15-30个氨基酸，介导了新生肽链分泌至细胞外，而分泌至细胞外的成熟蛋白则不含信号肽。信号肽包含三个区域：带正电荷的n端区域，称为碱性氨基末端；疏水区的h区域，以中性氨基酸为主，能够形成一段α螺旋结构；带负电的c端区域，是信号肽序列切割区域。尽管所有信号肽结构相同，但氨基酸组成具有较大差异，该异质性决定了蛋白转运能力的差异。yong jaelee等研究发现通过信号肽工程，通过对信号肽进行截短、延长或突变等方式，抗体的产量提高了2.5-3倍。研究发现，通过突变提高h区域的疏水性可以提高抗体重链的产量，进而提高完整抗体的产量。ryan haryadi等人筛选了8个重链信号肽和2个轻链信号肽，发现最好的轻链和重链信号肽组合抗体表达量提升2-4倍，突变重链信号肽中一个氨基酸，抗体表达量明显降低。

8、目前抗体常用表达载体为pcdna3.1(+)，但其表达重组抗体的能力不是很强，一些商业化载体虽然具有较强的抗体表达能力，但大多存在限制。因此，开发一种有较强抗体表达能力且不受限制的新型载体，在重组抗体的生产制备中具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种在cho细胞中抗体高表达的载体及其应用。本发明所述载体是基于pcdna3.1(+)载体骨架的新型载体，在cho细胞中具有较强抗体表达能力。本发明所述载体与其它商业化载体相比具有更优的抗体表达量，所述载体在抗体的生产制备中具有重要应用前景。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种在cho细胞中抗体高表达的载体，所述载体为采用如下元件中任意一种或至少两种的组合替换或插入pcdna3.1(+)中对应元件或对应位置得到；所述元件包括：

4、(1)promoter元件，所述promoter元件选自cmv promoter、chickenβ-actinpromoter、human ef-1αpromoter中任意一种；

5、(2)poly(a)元件，所述poly(a)元件选自β-globin poly(a)、bgh poly(a)、hsv tkpoly(a)、sv40 poly(a)中任意一种；

6、(3)intron元件，所述intron元件选自chimeric intron；

7、(4)wpre元件；

8、(5)信号肽元件，所述信号肽元件选自gaussia luciferase、serum albuminpreproprotein、ig kappa chain v-iii region mopc 321中任意一种。

9、本发明中wpre元件能显著提升基因表达，且不受细胞及物种限制；wpre与cmv启动子结合，抗体的表达量更高。本发明中的poly(a)元件对mrna的稳定性、翻译及转运具有重要作用；本发明中的intron元件可以提高转录本水平及增加mrna翻译效率；本发明中的信号肽元件介导了新生肽链分泌至细胞外。

10、优选地，所述cmv promoter的核苷酸序列包括：

11、(1)如seq id no:1所示的核苷酸序列；或

12、(2)与seq id no:1所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性并具有启动子元件活性的核苷酸序列。

13、优选地，所述chickenβ-actin promoter的核苷酸序列包括：

14、(1)如seq id no:2所示的核苷酸序列；或

15、(2)与seq id no:2所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性并具有启动子元件活性的核苷酸序列。

16、优选地，所述human ef-1αpromoter的核苷酸序列包括：

17、(1)如seq id no:3所示的核苷酸序列；或

18、(2)与seq id no:3所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性并具有启动子元件活性的核苷酸序列。

19、优选地，所述β-globin poly(a)的核苷酸序列包括：

20、(1)如seq id no:4所示的核苷酸序列；或

21、(2)与seq id no:4所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性并具有poly(a)元件活性的核苷酸序列。

22、优选地，所述bgh polya的核苷酸序列包括：

23、(1)如seq id no:5所示的核苷酸序列；或

24、(2)与seq id no:5所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性并具有poly(a)活性的核苷酸序列。

25、优选地，所述hsv tk polya的核苷酸序列包括：

26、(1)如seq id no:6所示的核苷酸序列；或

27、(2)与seq id no:6所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性并具有poly(a)元件活性的核苷酸序列。

28、优选地，所述sv40 poly(a)的核苷酸序列包括：

29、(1)如seq id no:7所示的核苷酸序列；或

30、(2)与seq id no:7所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性并具有poly(a)元件活性的核苷酸序列。

31、优选地，所述chimeric intron的核苷酸序列包括：

32、(1)如seq id no:12所示的核苷酸序列；或

33、(2)与seq id no:12所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性并具有intron元件活性的核苷酸序列。

34、优选地，所述wpre元件的核苷酸序列包括：

35、(1)如seq id no:11所示的核苷酸序列；或

36、(2)与seq id no:11所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性并具有wpre元件活性的核苷酸序列。

37、优选地，所述gaussia luciferase的核苷酸序列包括：

38、(1)如seq id no:8所示的核苷酸序列；或

39、(2)与seq id no:8所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性并具有信号肽元件活性的核苷酸序列。

40、优选地，所述serum albumin preproprotein的核苷酸序列包括：

41、(1)如seq id no:9所示的核苷酸序列；或

42、(2)与seq id no:9所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性并具有信号肽元件活性的核苷酸序列。

43、优选地，所述ig kappa chain v-iii region mopc 321的核苷酸序列包括：

44、(1)如seq id no:10所示的核苷酸序列；或

45、(2)与seq id no:10所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性并具有信号肽元件活性的核苷酸序列。

46、优选地，所述载体为采用gaussia luciferase、cmv promoter、hsv tk poly(a)、wpre、chimeric intron替换pcdna3.1(+)中对应元件得到；

47、或，所述载体为采用serum albumin preproprotein、cmv promoter、sv40 poly(a)替换pcdna3.1(+)中对应元件得到；

48、或，所述载体为采用serum albumin preproprotein、human ef-1αpromoter、β-globin poly(a)、wpre、chimeric intron替换pcdna3.1(+)中对应元件得到；

49、或，所述载体为采用serum albumin preproprotein、chickenβ-actin promoter、β-globin poly(a)、wpre、chimeric intron替换pcdna3.1(+)中对应元件得到；

50、或，所述载体为采用gaussia luciferase、chickenβ-actin promoter、bgh poly(a)、chimeric intron替换pcdna3.1(+)中对应元件得到；

51、或，所述载体为采用serum albumin preproprotein、cmv promoter、bgh poly(a)、wpre替换pcdna3.1(+)中对应元件得到。

52、优选地，所述载体的核苷酸序列包括：

53、(1)如seq id no:13所示的核苷酸序列；或

54、(2)与seq id no:13所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的核苷酸序列；

55、或，所述载体的核苷酸序列包括：

56、(1)如seq id no:14所示的核苷酸序列；或

57、(2)与seq id no:14所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的核苷酸序列；

58、或，所述载体的核苷酸序列包括：

59、(1)如seq id no:15所示的核苷酸序列；或

60、(2)与seq id no:15所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的核苷酸序列；

61、或，所述载体的核苷酸序列包括：

62、(1)如seq id no:16所示的核苷酸序列；或

63、(2)与seq id no:16所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的核苷酸序列；

64、或，所述载体的核苷酸序列包括：

65、(1)如seq id no:17所示的核苷酸序列；或

66、(2)与seq id no:17所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的核苷酸序列；

67、或，所述载体的核苷酸序列包括：

68、(1)如seq id no:18所示的核苷酸序列；或

69、(2)与seq id no:18所示的核苷酸序列具有至少80％序列一致性的核苷酸序列。

70、第二方面，本发明提供第一方面所述的在cho细胞中抗体高表达的载体的用途。

71、优选地，所述用途包括：

72、(1)重组质粒的构建；

73、(2)目的基因在宿主细胞中的瞬时表达；

74、(3)目的基因在宿主细胞中的稳定表达。

75、本发明中所述载体可以应用在重组质粒的构建，目的基因在宿主细胞中的瞬时表达，目的基因在宿主细胞中的稳定表达等领域中；表达的产物为蛋白(包括抗体，其中抗体包括单克隆抗体、双特异性抗体、片段抗体、纳米抗体、fc融合蛋白等，包括人，鼠等不同物种的igg、iga、igd、igm、ige等)；宿主细胞包括cho、hek293、mdck、vero等，不局限于cho细胞。

76、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

77、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

78、表达载体的选择对抗体质量和产量均有显著影响，因此，表达载体的筛选具有降本增效的作用，对于抗体药物的开发具有重要意义。本发明的载体能显著提高抗体在cho细胞中的表达量，能显著降低抗体药物在研发及生产中的成本。