高产T-2毒素的野生菌株、突变株及其用途

本发明属于应用微生物领域，尤其涉及一种可以合成t-2毒素菌株的筛选和高产突变株的构建方法及其应用。

背景技术：

1、单端孢霉烯毒素是由产毒真菌产生的有毒次级代谢产物，污染多种小麦、玉米等多种粮食作物，威胁粮食安全与人畜健康。毒理学研究发现，在目前已报道的190多种单端孢霉烯毒素中，t-2毒素(t-2toxin)的细胞毒性最强，是世界卫生组织国际癌症研究机构公布的3类致癌物。t-2毒素暴露可以造成多种急慢性中毒，诱导免疫系统细胞凋亡和胎儿致死反应，引发白血病。t-2毒素还有多种衍生化的代谢物，如ht-2、t-2-glu和ht-2-glu等。t-2毒素污染广泛，在世界多国的玉米、小麦、燕麦等谷物中均有污染报道，对人畜健康造成巨大威胁。鉴于t-2毒素及其衍生物的强毒性及污染严重程度，目前已有13个国家对食品和饲料中的t-2和ht-2毒素污染制定限量标准(25～1000μg/kg)，并对每日暴露量做了规定20ng/kg体重/天。基因组研究显示，t-2毒素主要由镰刀菌产生，部分镰刀菌种基因组中含有完整的t-2毒素合成基因簇，tri16基因的完整性决定了镰刀菌是否具有t-2毒素生物合成能力。

2、t-2毒素在环境中非常稳定，高温、紫外都难以彻底清除。因此，早期预警监测和污染阻断技术的研发是降低毒素污染的最有效的技术手段。真菌毒素精准、快速监测技术研发与应用需要毒素标准物质提供量值溯源基础；污染粮食生物降解等高效毒素防控技术研发也需要大量的毒素纯品。目前国内农产品质量风险监测及研发机构的毒素标准物质主要依赖国外进口，货期长，价格昂贵，1mg的t-2毒素价格约为5万元人民币。t-2毒素主要是从某些产毒镰刀菌的培养物中提取获得，产率非常低。

3、因此，筛选并通过遗传改造获得高产t-2毒素的菌株资源，并基于高产毒菌株构建t-2毒素宏量制备纯化技术，实现t-2毒素标准物质的国产化，对于粮食真菌毒素污染风险的持续监测和控制技术的研发意义重大。

技术实现思路

1、本技术提供一种高产t-2毒素的拟枝孢镰刀菌野生菌株及其突变体的构建方法及用途，可用于t-2毒素的宏量制备纯化，实现t-2毒素纯品的国产化，对于粮食真菌毒素污染风险的持续监测和控制技术的研发意义重大，具有广阔的应用前景。

2、一方面，本技术利用本单位建立的产毒真菌菌种资源库基，筛选到一株具有t-2毒素生物合成完整基因簇的拟枝孢镰刀菌f.sporotrichioides菌株fsp1，并对其产毒基因簇关键基因tri16进行扩增。菌株fsp1保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctcc m 2023693，保藏日期为2023年05月06日。

3、产t-2毒素的野生菌株fsp1在pda培养基上生长3天的形态学特征：红色菌落，菌丝密集呈棉絮状，可见大量气生菌丝。

4、通过引物对seq id no：1-2所示的鉴定引物扩增t-2毒素关键合成基因tri16(c-8酰基转移酶编码基因、genbank登录号ay187275)，并进行测序和比对，明确菌株fsp1具有t-2毒素生物合成关键基因tri16。

5、另一方面，本技术在拟枝孢镰刀菌中鉴定到一个调控t-2毒素生物合成的元件gp2，该基因编码一个异源三聚体g蛋白，可以负向调控t-2毒素的生物合成量。然后基于筛选到的具有t-2毒素完整合成基因簇的拟枝孢镰刀菌fsp1为受体菌株，利用基因靶向改造构建负调控元件gp2的敲除框，构建了高产t-2毒素的gp2缺失突变体菌株(△fspgp2)。在产毒诱导大米培养基中，△fspgp2的t-2毒素产量较野生型菌株fsp1提高14.6倍，产量为422mg/kg。

6、基于此，本发明提出如下申请：

7、本发明提供一种高产t-2毒素的野生菌株，分类命名为拟枝孢镰刀菌fusariumsporotrichioides，菌株编号为fsp1，保藏号为cctcc m 2023693。

8、本发明还提供一种高产t-2毒素的突变株，为野生菌株的gp2基因缺失突变体。

9、可选的，gp2基因的核苷酸序列如seq id no：3所示。

10、可选的，所述突变株为：gp2基因敲除框转化至如权利要求1所述野生菌株的原生质体中后筛选所得的抗性转化子。

11、可选的，所述gp2基因敲除框包括gp2基因编码区上游片段gp2-5’、gp2基因编码区下游片段gp2-3’和筛选标记基因neo，gp2基因编码区上游片段gp2-5’、gp2基因编码区下游片段gp2-3’分别连接在筛选标记基因neo两侧。

12、可选的，所述gp2基因编码区上游片段gp2-5’的核苷酸序列如seq id no：4所示；所述p2基因编码区下游片段gp2-3’的核苷酸序列如seq id no：5所示；所述筛选标记基因neo的核苷酸序列如seq id no：6所示。

13、本发明还提供一种所述突变株的构建方法，包括：

14、(1)鉴定调控基因gp2基因：从所述的野生菌株中鉴定得到核苷酸序列如seq idno：3所示可负向调控t-2毒素生物合成的调控基因gp2基因；

15、(2)构建gp2基因敲除框：所述gp2基因敲除框包括gp2基因编码区上游片段gp2-5’、gp2基因编码区下游片段gp2-3’和筛选标记基因neo，gp2基因编码区上游片段gp2-5’、gp2基因编码区下游片段gp2-3’分别连接在筛选标记基因neo两侧；

16、(3)转化、筛选：将所述gp2基因敲除框转化至所述野生菌株的原生质中，筛选gp2基因原位替换的转化子，即得。

17、步骤(1)中：

18、先从实验室保藏的12种镰刀菌78个菌株中，通过pcr扩增t-2毒素关键合成基因tri16及质谱检测方法，筛选获得3株具有t-2毒素完整合成基因簇可以合成t-2毒素的拟枝孢镰刀菌fusarium sporotrichioides菌株，取其中产毒力最高的一个菌株fsp1，保藏号为cctcc m 2023693；

19、然后利用比较基因组学和生物信息学预测鉴定到一个负向调控t-2毒素生物合成的元件gp2，该基因编码一个异源三聚体g蛋白，鉴定得到核苷酸序列如seq id no：3所示的gp2基因。

20、可选的，扩增t-2毒素关键产毒基因tri16的引物如seq id no：1和seq id no：2所示。

21、步骤(2)中：

22、可选的，构建gp2基因敲除框的方法包括：

23、利用双融合pcr，将所述gp2基因敲除框包括gp2基因编码区上游片段gp2-5’和gp2基因编码区下游片段gp2-3’连接至neo基因两侧，形成gp2基因敲除框△fspgp2(gp2-5’-neo-gp2-3’)。

24、可选的，所述gp2基因编码区上游片段gp2-5’的核苷酸序列如seq id no：4所示；所述p2基因编码区下游片段gp2-3’的核苷酸序列如seq id no：5所示；所述筛选标记基因neo的核苷酸序列如seq id no：6所示。

25、可选的，所述gp2基因编码区上游片段gp2-5’的扩增引物如seq id no：7和seq idno：8所示。

26、可选的，所述p2基因编码区下游片段gp2-3’的扩增引物如seq id no：9和seq idno：10所示。

27、可选的，筛选标记基因neo的扩增引物如seq id no：11和seq id no：12所示。

28、可选的，再设计引物seq id no：13和seq id no：14扩增gp2基因敲除框(gp2-5’-neo-gp2-3’)。

29、步骤(3)中：

30、可选的，所述gp2基因敲除框通过聚乙二醇peg介导的真菌原生质体转化方法转化至所述野生菌株的原生质体中。

31、进一步地，转化后，添加g418硫酸盐筛选抗性转化子，提取所得转化子基因组dna，进行pcr鉴定获得靶标基因的原位替换转化子，产毒验证后，即得所述高产t-2毒素突变株。

32、可选的，pcr鉴定的引物序列如seq id no：15和seq id no：16所示。

33、本技术还提供野生菌株或所述的突变株在制备t-2毒素中的用途。

34、本发明还提供一种宏量制备t-2毒素的方法，包括：

35、(1)在马铃薯培养基平板pda上活化如权利要求1所述野生菌株或如权利要求2所述突变株；

36、(2)取活化后的菌块接种至大米培养基，25～30℃摄氏度，黑暗培养20～25天；

37、(3)收集并干燥大米培养物，磨粉后提取t-2毒素。

38、进一步优选的，宏量制备t-2毒素的方法包括：

39、(1)在马铃薯培养基平板pda上活化如权利要求1所述野生菌株或如权利要求2所述突变株，25℃，光照培养3天；

40、(2)取5mm大小菌块接种至大米培养基，28℃，黑暗培养20～25天；

41、(3)培养物干燥磨粉后，使用含1％甲酸的50％乙腈水溶液提取，使用高效液相逆流色谱技术纯化t-2毒素，制备纯溶液。

42、一种异源三聚体g蛋白编码基因gp2，其核苷酸序列如seq id no：3所示。

43、一种gp2基因敲除框，包括gp2基因编码区上游片段gp2-5’、gp2基因编码区下游片段gp2-3’和筛选标记基因neo，gp2基因编码区上游片段gp2-5’、gp2基因编码区下游片段gp2-3’分别连接在筛选标记基因neo两侧。

44、可选的，所述gp2基因编码区上游片段gp2-5’的核苷酸序列如seq id no：4所示。

45、可选的，所述p2基因编码区下游片段gp2-3’的核苷酸序列如seq id no：5所示。

46、可选的，所述筛选标记基因neo的核苷酸序列如seq id no：6所示。

47、所述gp2基因敲除框的构建方法包括：

48、利用双融合pcr，将该基因编码区上游片段(gp2-5’)和下游片段(gp2-3’)连接至neo基因两侧，形成gp2基因敲除框(gp2-5’-neo-gp2-3’)。

49、一种所述异源三聚体g蛋白编码基因gp2或gp2基因敲除框在负向调控拟枝孢镰刀菌fusarium sporotrichioides t-2毒素产量中的用途。

50、本发明相对于现有技术至少取得了如下有益的技术效果之一：

51、(1)筛选获得我国自然界来源的产t-2毒素野生型菌株fsp1；

52、(2)野生型菌株fsp1产毒力达28.9mg/kg，相比其他产t-2毒素的镰刀菌，其t-2毒素产量也有明显提高；

53、(3)利用生物信息学和比对从野生型菌株fsp1中预测鉴定到一个t-2毒素合成负调控元件gp2；

54、(4)利用基因改造构建gp2基因敲除框，转化至fsp1菌株中，筛选获得原位替换的敲除突变体△fspgp2；

55、(5)建立大量培养制备t-2毒素方法，产量为422mg/kg大米。