可排除SMN2干扰的SMN1基因检测的试剂盒及检测方法

本发明涉及分子生物学，特别是涉及一种可排除smn2干扰的smn1基因检测的试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、脊髓型肌萎缩症(spinal muscular atrophy,sma)是一类相对常见的常染色体隐性遗传病，以脊髓前角运动神经元退化变性和丢失导致的肌无力和肌萎缩为主要临床特征。sma发病率为1/10000～1/6000，携带率为1/50～1/40。sma的发病原因主要是由于位于5q13.2上的运动神经元存活基因1(survival motor neuron gene 1，smn1)上的7号外显子第6个碱基由c突变为t，导致smn蛋白功能缺陷所致的遗传性神经肌肉病。smn是一个广泛表达的管家蛋白，可作为亚单位与sm蛋白结合，以smn复合体形式募集sm核蛋白和小核核糖核酸(snrnas)组装成核糖核蛋白复合物(snrnps)。此外，smn2作为脊髓性肌萎缩症(sma)的修饰基因，存在于每个人的体内，且smn2与smn1的基因序列仅有个别碱基的差异(如图2)，因此，在检测过程中smn2对基因筛查存在较大的干扰作用，往往很难区分smn1基因突变携带者和纯合正常人。虽然，目前已经研制出了针对sma的有效药物，但仍需要早发现早治疗，尤其是针对婴儿期的sma患者治疗效果更佳，而且治疗费用极高。因此，对smn1基因型进行婚前筛查，降低新生儿患sma风向至关重要。

2、目前，针对sma的基因检测技术主要是基于聚合酶链式反应(pcr)、实时定量pcr(rt-pcr)、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(pcr-rflp)、单链构象多态性(pcr-sscp)、多重连接探针扩增技术(mlpa)、荧光原位杂交技术(fish)等，然后结合核酸测序技术进行序列分析。但是，上述技术均是基于pcr技术的体外扩增，但是由于受pcr技术的灵敏度限制，检测结果有一定失败的可能性。另一方面由于pcr技术由于dnapolymerase扩增过程中有一定几率出现扩增变异，因此，也存在一定的假阳性率。且上述技术的检测时间长、费用高，在基层医疗单位推广普及的难度较高。

3、环介导等温扩增技术(lamp)由于其对检测设备的要求较低，操作简便，以及高灵敏度，目前已经广泛应用于病原微生物的检测中。近年来也研究报道利用lamp法检测基因突变，如专利文献cn 105861690a利用肽核酸(pna)制备的探针与dna或rna能够形成稳定的复合体，而单碱基突变能够引起该复合体较大tm值变化的原理，与lamp技术结合。但目前肽核酸合成技术仍不成熟，合成的pna纯度一般仅能达到90％-95％，同时，肽核酸合成成本较高，合成50nmol的费用高达5000-6000元左右，检测费用高，推广难度大。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、可排除smn2干扰的smn1基因检测的试剂盒，该试剂盒包括引物组、bstdnapolymerase、dntp、缓冲液、指示剂和添加剂；

4、所述引物组包括以下7条引物；

5、f3：5’-gctatctatgtctatatagctat-3’；

6、b3：5’-gttttggcatcaaaattctttaat-3’；

7、fip-w:5’-tgctggcagacttactccttaactttattttccttacagggt tvc-3’；

8、fip-m:5’-tgctggcagacttactccttaactttattttccttacagggt tvt-3’；

9、bip-w:5’-tgaaagtgaatcttacttttgtaaaagttttacattaacct ttcaacttvt-3’；

10、lf：5’-gtgagcaccttccttcttttt-3’；

11、lb：5’-gtggaaaacaaatgtttttgaac-3’；

12、所述的缓冲液包括tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgso4和tween-20；

13、所述的指示剂为sybr green i溶液或calcein溶液和mncl2溶液的混合液；

14、所述的添加剂包括海藻糖和bsa。

15、所述引物f3、b3浓度相同，为0.8～1.6μmol/l，lf、lb浓度相同，为1.6～3.2μmol/l，fip-w、fip-m、bip-w浓度相同，为1.6～3.2μmol/l；所述的bst dnapolymerase0.3～0.4u/μl；所述的dntp为1.0～3.5mmol/l；所述的缓冲液中tris-hcl为10～50mmol/l、kcl为10～100mmol/l、(nh4)2so4为5～20mmol/l、mgso4为6～10mmol/l、tween-20质量占缓冲液质量为0.1％～0.5％；所述的sybr green i浓度为1×～5×；所述的calcein和mncl2的混合液中，calcein溶液浓度为10-30μmol/l，mncl2溶液的为500μmol/l；所述的添加剂中海藻糖为0.1～0.3mol/l，bsa为0.2～1mg/ml；fip-w特异性扩增smn1-w，fip-m特异性扩增smn1-m。

16、可排除smn2干扰的smn1基因的检测方法，包括以下步骤：

17、将口腔拭子放入200μlte缓冲液中涡旋震荡1min，100℃加热5min，得到待测试模板；

18、分别将smn1-w和smn1-m基因连接到puc57载体上，并稀释至1ng/μl，作为阳性对照；以无菌超纯水作为阴性对照；

19、利用lamp技术，分别取待测试模板、阳性对照和阴性对照加入到权利要求1所述的试剂盒体系中，整个反应体系于65℃45sec，65℃15sec的条件下反应60个循环；然后85℃反应5min，根据反应曲线判断smn1基因的基因型。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

21、(1)本发明利用lamp技术将待测碱基位于引物3’端，同时人为的突变待测碱基相邻位置的碱基，从而使dna聚合酶在扩增过程中能够准确识别位于引物3’端的待测碱基，显著提高了bst dnapolymerase对引物3’端的识别能力，避免了探针的设计和使用，降低了检测费用，提高了检测试剂保存的稳定性；

22、(2)本发明的检测方法采用环介导等温扩增技术，具有极高的灵敏度，因此，仅需患者少量口腔拭子经过煮沸释放dna即可作为模板进行扩增，不需采集血液标本；

23、(3)本发明无需进行dna提取操作，口腔拭子经过煮沸即可作为模板，结合冷冻干燥技术，整个检测过程只需加入少量的口腔拭子粗提液和反应缓冲液即可，极大的简化了操作步骤；

24、(4)本发明通过对smn1和smn2两个不同位点同时进行检测实现了快速鉴别smn1基因纯合突变、纯合正常、杂合突变，能够有效避免smn2基因对检测结果的干扰。并且对检测设备没有特殊要求，仅需一台水浴锅或其他能够提供恒温条件的设备和一台蓝光灯即可。该技术在实现精准检测的同时，也实现了即时检测，并降低了检测费用和推广难度。