一种胎盘巨噬细胞的提取和扩增培养方法与流程

本发明属于再生医学和生物学，具体涉及一种胎盘巨噬细胞的提取和扩增培养方法。

背景技术：

1、巨噬细胞是一类重要的天然免疫细胞，来源于外周血中的单核细胞，具有吞噬降解细菌、释放炎症介质、介导炎性细胞趋化、抗原提呈等活性，在抗感染、抗肿瘤免疫中发挥着非常重要的作用。因此研究巨噬细胞的功能，对于深入理解机体免疫防御和免疫调节机制具有重要意义。

2、作为胎盘中的主要免疫细胞，巨噬细胞通过吞噬及分泌炎性因子等方式，在抵抗病原体入侵及炎症反应过程中起到了重要的作用，并且随着孕期进展，胎盘中巨噬细胞数逐渐增多，并且在胎盘绒毛间质间自由移动。研究发现，子痫前期、妊娠期糖尿病、早产及流产等多种妊娠期疾病的发生发展都与胎盘巨噬细胞功能异常或减退相关。

3、巨噬细胞占胎盘免疫细胞总数的 20%～30%。研究证明，巨噬细胞通过分泌抗炎因子在胎盘组织中起着免疫抑制作用，并调控着胎盘滋养细胞的侵袭能力。最新研究发现，巨噬细胞在母胎界面的表型转换和活化与胎盘局部的微环境有关，其活化异常与妊娠期疾病发生密切相关。目前常用的巨噬细胞模型是从腹腔液或血液中提取，但无论哪一种模型都无法完全替代胎盘原代巨噬细胞。

4、目前从腹腔或血液中提取出来的巨噬细胞数量有限，且细胞潜伏期比较长，细胞的体外增殖时间长。培养体系有限，不能为刚酶解细胞提供充足的营养成分，原代培养周期过长，且巨噬细胞的体外培养，仅限原代培养，暂未见巨噬细胞的体外传代培养体系。

技术实现思路

1、基于上述技术背景，本发明提供一种胎盘巨噬细胞的提取和扩增培养方法，创造性的采用胰蛋白酶替代物和中性酶提取胎盘巨噬细胞，大大的提高了巨噬细胞的活率，使提取的细胞数量和活力高，短时间内即可获得数量巨大的巨噬细胞，且提取出的细胞污染率低，可显著提高分离提取效率。此外，本发明采用581基础培养基和αmem基础培养基，同时添加细胞培养添加剂，混合了贴壁细胞培养基和悬浮细胞培养基，为巨噬细胞提供了两种类型的成分供给，使提取出的巨噬细胞在第2天即可进入细胞增殖期，且能够成功传代，解决了巨噬细胞获取难度大、培养周期过长的问题，同时实现了巨噬细胞的传代培养，从而完成本发明。

2、本发明在于提供一种胎盘巨噬细胞的提取和扩增培养方法，所述提取和扩增培养方法包括以下步骤：

3、步骤1、将足月分娩的胎盘进行清洗后，除去大血管、结缔组织、小血管和纤维连接成分，然后将胎盘组织剪碎，向其中加入由胰蛋白酶替代物、中性蛋白酶和基础培养基组成的消化液，经搅拌消化、过滤，得到过滤液，向其中加入血清替代品终止消化，然后离心、弃上清液，随后加入预冷红细胞裂解液进行冰浴，再次离心，弃上清液后进行洗涤，最后经过离心、弃上清液、加培养基重悬细胞，得到重悬细胞混合液；

4、步骤2、将重悬细胞混合液缓慢添加至淋巴细胞分离液上层，经离心后，用吸管将处于基础培养基和淋巴细胞分离液交界面处的巨噬细胞吸出，然后向巨噬细胞中添加基础培养基，经离心后，弃上清液，得到提取纯化的巨噬细胞；

5、步骤3、将步骤2提取纯化的巨噬细胞接种于扩增培养基中进行培养，接种培养48h后，弃上清液，得到扩增培养的巨噬细胞。

6、进一步地，步骤1中，所述消化液中胰蛋白酶替代物的质量浓度为0.04～0.1%，中性蛋白酶的浓度为0.05～0.2g/ml。

7、进一步地，步骤1中，搅拌消化的次数为2～5次，每次搅拌消化的时间为5～15min。

8、进一步地，步骤1中，第一次离心的条件为：于3～5℃、800～1200g离心5～15min；

9、所述冰浴时间为20～45min。

10、进一步地，步骤1中，第二次离心温度为3～5℃，离心转速为800～1200r/min，离心时间为3～10min；

11、第三次离心温度为2～5℃，离心转速为900～1200r/min，离心时间为4～10min。

12、进一步地，步骤2中，第一次离心温度为2～4℃，离心转速为400～700g，离心时间为10～30min；

13、第二次离心条件为：温度3～5℃，离心转速为400～600g，离心时间为5～20min。

14、进一步地，步骤3中，所述扩增培养基包括混合基础培养基和细胞培养添加剂，所述混合基础培养基为581基础培养基和αmem基础培养基组成的混合基础培养基，所述细胞培养添加剂包括血清替代品、谷氨酰胺和neaa。

15、更进一步地，所述581基础培养基和αmem基础培养基的体积比为（1～2）:1。

16、所述扩增培养基中含有4～7wt%的血清替代品、0.002mol/l的谷氨酰胺和0.1mmol/l的neaa。

17、本发明所具有的有益效果：

18、（1）本发明创造性的采用双酶法提取胎盘巨噬细胞，该方法操作步骤简单，提取和扩增培养时间短，细胞获取量大、获取率高，提取的细胞数量足够、细胞活率高，提取得到的细胞污染率极低，此外，本发明优化了巨噬细胞的培养体系，大大缩短了细胞的原代培养周期，同时可实现巨噬细胞的传代培养；

19、（2）本发明选用健康分娩的胎盘，采用低温胎盘保存液对胎盘进行保存，在24小时后进入试验流程，提取出的巨噬细胞活性高；

20、（3）胎盘组织采用双酶法进行酶解，不采用胰酶和dna酶等酶解作用强烈的酶解液进行酶解，而采用胰酶替代物和中性酶两种酶解液充分消化胎盘组织，使得巨噬细胞能迅速提取出来而不被伤害，酶解液中采用581基础培养基作为溶剂，在酶解过程中为细胞提供很好的营养供给，保证了细胞的活性。

技术特征：

1.一种胎盘巨噬细胞的提取和扩增培养方法，其特征在于，所述提取和扩增培养方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的提取和扩增培养方法，其特征在于，步骤1中，

3.根据权利要求1所述的提取和扩增培养方法，其特征在于，步骤1中，

4.根据权利要求1所述的提取和扩增培养方法，其特征在于，步骤1中，

5.根据权利要求1所述的提取和扩增培养方法，其特征在于，步骤1中，

6.根据权利要求1所述的提取和扩增培养方法，其特征在于，步骤2中，

7.根据权利要求1所述的提取和扩增培养方法，其特征在于，步骤3中，

8.根据权利要求7所述的提取和扩增培养方法，其特征在于，

9.根据权利要求7所述的提取和扩增培养方法，其特征在于，

技术总结
本发明属于再生医学和生物学技术领域，具体涉及一种胎盘巨噬细胞的提取和扩增培养方法，所述方法采用较为温和的酶解液充分消化胎盘组织，可使巨噬细胞迅速提取出来而不被伤害，有效提高巨噬细胞的活率和数量，可在短时间内获得数量充足的巨噬细胞，显著提高分离提取效率，在体外扩增培养阶段采用混合贴壁细胞培养基和悬浮细胞培养基，为巨噬细胞提供充足的营养供给，大大缩短原代培养周期，且能成功实现细胞的传代培养，解决了巨噬细胞获取难度大、培养周期长的问题，为胎盘巨噬细胞的体外扩增培养提供了新途径。

技术研发人员：谢佳琦,卢瑞珊,高大
受保护的技术使用者：广州正源生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13