基于Cas12a的PRV野毒株和gE/TK基因缺失疫苗株鉴别诊断方法

本发明属于生物与化学领域，涉及一种利用crispr/cas12a体系可视化检测猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus，prv)的方法。

背景技术：

1、规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly inter spaced shortpalindromic repeats,crispr)/crispr相关蛋白(crispr associated proteins,cas)系统是细菌和古细菌的适应性免疫系统。cas12a属于第2类ⅴ型免疫系统，这类免疫系统可结合特定的crrna(crispr rna，crrna)，再通过crrna碱基互补配对特异性识别带有前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif，pam)标签的靶双链dna序列，其中cas12a识别的pam序列一般为5’-tttn-3’。识别并结合靶序列后，cas12a蛋白的反式切割活性被激活，开始无差别的切割体系中的单链dna探针，基于这一特性，cas12a可被开发用于核酸检测。

2、猪伪狂犬病(pseudorabies，pr)是由prv感染引起的一种多种哺乳动物共患的急性接触性传染病，可导致妊娠母猪和种公猪的繁殖障碍，以及哺乳仔猪高达百分之百的死亡率，对世界范围内的猪养殖业造成了巨大的经济损失。prv基因组为线性的双链dna，全长约150kb，编码约100种蛋白，其中糖蛋白11种(gb,gc,gd,ge,gg,gh,gi,gk,gl,gm和gn)。其中，gb(全长约2745bp)编码的gb蛋白是病毒囊膜的组成成分，是prv复制所必需的，一些与免疫相关的毒力基因，如ge(全长约1740bp)和tk(全长约960bp)，缺失并不影响病毒的复制以及免疫原性，但会大幅度的降低病毒的毒力和侵袭力，因此，缺失这些基因基的prv毒株可作为疫苗用于防控pr。我国是猪肉生产和消费大国，从上世纪起，我国开始将ge基因缺失的bartha株用于猪伪狂犬防控，之后又研发出了ge基因缺失的c株、tk基因缺失的hb-98株和ge/tk基因缺失的hb2000株，基因缺失弱读疫苗的使用在我国猪伪狂犬防控中起到了不可或缺的作用。因此，为了精准区分疫苗接种猪和野毒感染猪，及时淘汰阳性猪，一种快速、灵敏、可靠、便捷的prv野毒株和基因缺失疫苗株的诊断鉴别技术有着极大的市场需求。然而，传统的prv检测方法，如pcr、elisa等，对昂贵的仪器设备和操作者的先验知识要求较高，难以满足现场的便捷检测的需求，因此，克服传统检测方法的诸多局限，引入前沿技术，开发出高效、便捷、灵敏、特异的猪伪狂犬病毒检测技术具有重大意义。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种基于crispr/cas12a的可视化prv野毒株和ge-/tk-基因缺失疫苗株鉴别诊断方法。

2、为解决上述技术问题，本发明提供一种基于crispr/cas12a的可视化猪伪狂犬野毒株和ge-/tk-基因缺失疫苗株鉴别的crrna，设定的crrna序列为：

3、gb-crrna-5’-uaauuucuacuaaguguagauugcgcacgccgcacuucacg-3’，ge-crrna-5’-uaauuucuacuaaguguagauuccggaucgcggaaccagac-3’，tk-crrna-5’-uaauuucuacuaaguguagauggcgcguacaaggcgcccga-3’。

4、本发明还同时提供了基于crispr/cas12a的可视化猪伪狂犬野毒株和ge-/tk-基因缺失疫苗株鉴别的引物和探针：

5、恒温扩增引物为：

6、mira-gb-f-5-’cgtgtacatgtcccccttctac-3’，

7、mira-gb-r-5’-ggatcatctcctcggcct-3’，

8、mira-ge-f-5’-cacatgctctctccggtgt-3’，

9、mira-ge-r-5’-tcgtcacttccggtttctcc-3’：

10、mira-tk-f-5’-agctccaggacaccctctttcgg-3’，

11、mira-tk-r-5’-acacgcactgccggatgtgg-3’；

12、fam-bhq1单链dna探针为5’-fam-ttatt-bhq1-3’；

13、gb，ge和tk基因全长扩增引物为：

14、gb-f-5’-tgacctacgaggcgtcatgcc-3’，

15、gb-r-5’-ttcttcttgcgcgccttgtgc-3’，

16、ge-f-5’-atgcggccctttctgct-3’，

17、ge-r-5-‘ttaagcggggcgggacat-3’，

18、tk-f-5’-aagcccgaagagactctcgc-3’，

19、tk-r-5’-tcacacccccatctccgac-3’；

20、为三个基因两端添加同源臂的引物为：

21、piers2-gb-f-5’-ccgtcagatccgctagctgacctacgaggcgtcatg-3’，

22、piers2-gb-r-5’-ggttcagggggaggatccttcttcttgcgcgccttg-3’，

23、piers2-ge-f-5’-aaccgtcagatccgctagcatgcggccctttctg-3’，

24、piers2-ge-r-5’-gttcagggggaggatccttaagcggggcggga-3’，

25、piers2-tk-f-5’-gtcagatccgctagcatgcgcatcctccgg-3’，

26、piers2-tk-r-5’-tcagggggaggatcctcacacccccatctccgac-3’。

27、本发明通过设计恒温扩增引物mira-gb-f/mira-gb-r，mira-ge-f/mira-ge-r，mira-tk-f/mira-tk-r，通过mira对prv三个靶标基因片段进行扩增。

28、本发明还同时提供了一种基于crispr/cas12a的可视化猪伪狂犬野毒株和ge-/tk-基因缺失疫苗株鉴别诊断方法，包括以下步骤：

29、步骤一、病毒基因组的提取；可根据易思得血液/组织基因组提取试剂盒说明书提取待测样本的中的prv；

30、步骤二、利用上述恒温扩增引物，将被提取的病毒基因组通过恒温扩增技术进行扩增；可根据安普未来mira核酸恒温扩增试剂盒所附说明书对待测核酸进行恒温扩增；

31、步骤三、将扩增完成的产物用于cas12a检测。

32、作为本发明的鉴别诊断方法的改进，本发明的基于crispr/cas12a技术原理为：

33、从样本中提取的病毒基因组通过mira恒温扩增技术进行靶基因的预扩增，cas12a蛋白和crrna在37℃会相互结合形成crrna/cas12a蛋白复合物，之后，crrna通过碱基互补配对识别靶标双链dna，三者结合形成crrna/cas12a/靶标dna三元复合物，复合物形成后，cas12a蛋白的反式切割活性被激活，开始无差别的剪切体系中的单链dna，当体系中一端为fam荧光基团，一端为荧光猝灭基团的单链dna探针被切断以后，fam基团在470nm的led蓝光激发下，能发出肉眼可见的绿色荧光；若反应后的检测体系有发光现象，则说明该靶标检测结果为阳性，否则则为阴性。

34、作为本发明的鉴别诊断方法的进一步改进：

35、所述步骤二中：

36、mira恒温扩增体系为50μl，包括a buffer 29.4μl，mira-gb-f，mira-gb-r，mira-ge-f，mira-ge-r，mira-tk-f和mira-tk-r各2μl，dna模板2μl，depc水12.1μl，b buffer 2.5μl，37℃反应20分钟。

37、作为本发明的鉴别诊断方法的进一步改进：

38、所述步骤三中：

39、cas12a可视化检测体为10μl，包括：cas12a蛋白50～100nm，crrna 70～140nm，单链dna探针1μl，mira扩增产物2μl，1×neb 2.1buffer，加depc水至10μl，37℃反应15分钟，于470nm蓝光切胶仪下观察荧光。

40、作为本发明的鉴别诊断方法的进一步改进：

41、步骤三为：

42、在cas12a检测阶段，首先将待测样本与三种crrna(本发明的三个基因特异crrna，gb-crrna，ge-crrna，tk-crrna)分别放于三个试管在37℃孵育3～5分钟；crrna与待测样本的摩尔比为1：1～2：1(crrna/cas12a蛋白摩尔比优选1.4：1)；

43、之后，往三个试管中均加入fam-bhq1单链dna探针1μl(浓度为10μm)，步骤二所得的mira恒温扩增产物2μl，1×neb 2.1buffer，最后加depc水至10μl混匀，于37℃反应15min，再将三个试管放于470nm蓝光切胶仪观察荧光，然后按照下述判断规则进行预判：

44、①三个管都有荧光，则表示待测样本为野毒株感染；

45、②有gb管发出荧光，另外两管无荧光，则表示待测样本为ge和tk双基因缺失疫苗株；

46、③有ge管不发出荧光，则表示待测样本为ge缺失疫苗株；

47、④有tk管不发出荧光，则表示待测样本为tk缺失疫苗株；

48、⑤三个试管均无荧光，则表示检测结果为阴性(即所测样本既未注射疫苗，也未感染prv野毒株)。

49、从而实现prv野毒株和疫苗株的可视化检测。

50、本发明是为了克服现有prv诊断技术耗时、高成本等缺点，基于cas12a蛋白，结合mira(multienzyme isothermal rapid amplification,mira)dna恒温扩增增技术，研发出了一种可视化的prv野毒株和ge/tk基因缺失疫苗株快速鉴别诊断方法。本发明的目的在于建立一种prv野毒株和ge/tk基因缺失疫苗株的快速、灵敏的鉴别诊断技术，以精准区分疫苗接种猪和野毒感染猪，及时淘汰阳性猪。本发明阐述的检测方法极大的提高了prv检测方法的准确度、便捷性和检测效率。

51、即，本发明通过mira核酸恒温技术扩增猪伪狂犬病毒的靶序列，根据靶序列设计特异性靶向病毒基因组的crrna，再通过cas12a蛋白，结合crrna，来检测靶标dna。

52、本发明的可视化检测对象为猪伪狂犬野毒株和ge-/tk-基因缺失疫苗株。

53、本发明的prv野毒株和ge/tk基因缺失疫苗株的可视化诊断鉴别方法，包括cas12a蛋白，crrna，mira扩增引物，包含感染prv的样本三种标准重组质粒、一些常用的市场商业prv活疫苗以及感染和未感染prv的临床样本。

54、本发明的crrna合成及纯化方法为：将结构为“t7启动子-cas12a骨架序列-spacer序列”的序列以及其互补的序列通过退火合成双链，以此双链为模板，在t7 rna聚合酶作用下转录合成crrna，转录体系包括：1μl t7聚合酶，4μl双链dna模板，1μl atp，1μl utp，1μlctp，1μl gtp，1×neb 2.1buffer，37℃过夜后再纯化即可。其中，体外转录试剂盒为购于南京诺维赞生物科技股份有限公司的t7 high yield rna transcription kit，rna纯化试剂盒为购于new england biolabs的monarch rnacleanup kit。

55、相比现有猪伪狂犬病毒检测技术，本发现的优势表现在：

56、(1)本发明首次公开一种基于crispr/cas12a的猪伪狂犬野毒株和tk/ge基因缺失疫苗株的快速诊断鉴别方法，对猪伪狂犬病毒的快速分子检测研究以及猪伪狂犬阳性猪的筛查和早期诊断具有重要意义。

57、(2)采用本发明提供的检测方法对猪伪狂犬野毒株(df株和ea株)和疫苗株(bartha-k61株，c株和hb98株)以及猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒进行检测，检测见过显示本发明提供的检测方法可以很好的诊断和鉴别猪伪狂犬野毒株和疫苗株，同时，在检测其他病毒时不产生荧光反应。同时对本发明提供的检测方法进行灵敏度检测，最低可检测101拷贝目标质粒。

58、(3)本发明提供的猪伪狂犬野毒株和疫苗株检测鉴别方法和技术平台仅需35分钟(恒温扩增20分钟，crispr/cas12a反应15分钟)即可达到可视化检测效果。在猪养殖场的日常传染病筛查和早期淘汰阳性感染猪中能发挥重要作用。

59、(4)本发明创新性研发了一种可以克服pam序列对cas12a蛋白限制性的prv检测方法，能在很大程度拓宽cas12a的应用范围。

60、(5)本发明提供的检测方法在整个检测过程中只需要一个37-42℃的恒温热源和470nm的激发光源，在条件有限的乡村和野外也同样适用。

61、综上，本发明提供了一种基于crispr/cas12a蛋白的可视化鉴别诊断猪伪狂犬病毒野毒株和ge/tk基因缺失疫苗株的方法，具体步骤包括如下：借助miradna恒温扩增技术在37℃预扩增猪伪狂犬病毒gb，ge和tk基因，在crrna介导下，cas12a可以特异性识别靶dna序列，识别后其反式切割活性被激活，可无差别的剪切体系中一端为fam荧光基团另一端为bhq1猝灭基团的单链dna探针，在470nm蓝光激发下，探针可发出肉眼可见的荧光，以此作为阳性的判定指标。该方法操作简单，具有优越的灵敏度和特异性，且无需昂贵的实验室仪器，在防控和净化猪伪狂犬上具有一定的发展和应用前景。