检测DMD基因变异的方法及装置和探针、试剂盒与流程

本技术涉及分子生物学及生物信息学，特别是涉及一种检测dmd基因变异的方法及装置和探针、试剂盒。

背景技术：

1、这里的陈述仅提供与本技术有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

2、假肥大型肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy，dmd)是由dmd基因突变所致的x连锁的隐性单基因遗传病，是一种比较常见的严重致死性遗传性肌肉疾病。dmd在新生男性婴儿中的发病率为1/3500，目前对于dmd的治疗尚无有效的手段，因此，对于dmd基因变异的高效且准确的检测尤为重要。

3、dmd基因位于x染色体上，长度为2.4mb，包含79个外显子，是目前发现的人类最大的基因。dmd基因致病突变类型多，包括单核苷酸变异(snv)，小片段插入缺失(indel)，大片段缺失和重复(cnv)。在大片段的缺失和重复中，其中大片段缺失(≥1个外显子)约占全部突变的55％～65％，最常见的缺失区域是位于dmd基因中央区域45～55号外显子，约占80％；另一个热点区域位于基因5’端2～20号外显子，约占20％。大片段重复(≥1个外显子)约占5％～10％，最常见的重复区域为2～9号外显子。基因中外显子和侧翼区域的突变约占20％，无明显的热点区域；剪切位点突变占1％；indel约占7％，除此之外，还有部分突变位于内含子区域。

4、目前，dmd基因突变的检测方法主要有以下几种：微阵列比较基因组杂交技术(a-cgh)、多重连接探针扩增技术(mlpa)、多重pcr(multiplex pcr)、双脱氧核苷酸末端终止法(sanger sequencing)和第二代测序技术(next-generation sequencing，ngs)等。acgh无法检测点突变，且设备、芯片制备和分析等成本都较高等缺点，导致acgh难以广泛用于dmd的诊断。mlpa也有其缺点：1、不能检测snv；2、mlpa可检测外显子的缺失或重复，但可能漏检部分缺失或重复，尤其是用于检测缺失或重复片段较小的女性携带者时，漏检发生率更高，出现假阴性；3、当snv发生在探针连接点上时，探针捕获目标区域失败，易被误判为整个外显子的缺失，出现假阳性。多重pcr分析技术，受限于引物的设计和扩增效率，适用于对缺失范围大且热点的区域进行快速的检测，能够发现98％的大片段缺失，具有成本低、实验周期短的优势，但很难检测出单个外显子级别的缺失重复。sanger测序只能检测snv和indel，且检测的核酸长度有限(<1kb)，dna用量大，尤其在检测诸如dmd这样庞大而有众多外显子的基因时，很难得到广泛的应用。ngs定量不够准确，检测cnv的效果较差；对dmd基因2个外显子以下的拷贝数变异容易漏检。

5、由于dmd基因的突变在基因上的分布范围广且类型繁多，目前很难被单一的临床检测技术一次性全部检出。如何实现一体化高效检测dmd基因上发生的cnv、snv和indel，且覆盖突变种类更为全面的检测方法及产品，以期实现对dmd基因的缺失型和突变型的高效、准确和全面检测，目前暂未有记载。

技术实现思路

1、基于此，有必要提供一种检测dmd基因变异的方法，用于一体化高效检测dmd基因变异。

2、本技术的第一个方面，提供了一种检测dmd基因变异的方法，包括对待测样本进行snv、indel和cnv检测分析；

3、其中，对待测样本进行snv和indel检测分析时，包括如下步骤：获取待测样本的测序数据，所述测序数据为使用预设探针杂交捕获后得到的测序数据；将所述待测样本的测序数据与人类参考基因组进行比对；根据比对结果得到关于待测样本的snv和indel变异结果。

4、对待测样本进行cnv检测分析时，包括如下步骤：分别获取待测样本的测序数据和对照样本的测序数据，所述测序数据为使用预设探针杂交捕获后得到的包含靶标区域和非靶标区域的测序数据；分别将所述待测样本的测序数据和所述对照样本的测序数据进行窗口划分，其中，靶标区域按照90bp～200bp的长度进行窗口划分，非靶标区域按照25kb～35kb的长度的进行窗口划分；将所述待测样本的测序数据和所述对照样本的测序数据进行比对，获得待测样本各窗口的log2ratio值；根据所述log2ratio值鉴别待测样本的cnv变异结果。

5、在其中一个实施例中，所述预设探针探针覆盖的区域为chrx:31137039-33357605，参考grch37.p13版本；探针的长度为90bp～120bp；探针的gc含量为45％～55％；探针密度根据探针杂交捕获区域的gc含量确定：对于gc含量为40％～60％的探针杂交捕获区域，所述探针密度为0.5～1.5；对于gc含量为30％～39％和61％～70％的探针杂交捕获区域，所述探针密度为1～6；对于gc含量为15％～29％和71％～80％的探针杂交捕获区域，所述探针密度为4～24。

6、在其中的一个实施例中，所述预设探针包括序列分别如seq id no.1～seq idno.43所示的rna探针或其对应的dna探针。

7、在其中一个实施例中，对待测样本进行cnv检测分析时，比对的步骤包括：分别获取各窗口待测样本的reads数目r1与对照样本的reads数目r2，根据r1和r2分别计算各窗口待测样本的平均测序深度x和对照样本的平均测序深度y，log2(x/y)即所述的log2ratio值。

8、在其中一个实施例中，对待测样本进行cnv检测分析时，还包含分别对待测样本的reads数和对照样本的reads数进行数据矫正的步骤；所述数据矫正的过程包括gc校正和标准化。

9、在其中一个实施例中，对待测样本进行cnv检测分析时，根据所述log2ratio值鉴别待测样本的cnv变异结果包括：根据待测样本各窗口的log2ratio值分析待测样本各窗口的cnv变异类型；合并待测样本中cnv变异类型相同且其间隔的长度小于1000bp的相邻窗口；根据合并的各窗口的cnv变异类型鉴别待测样本的cnv变异结果。

10、本技术的第二个方面，提供了一种检测dmd基因变异的装置，包括snv与indel检测分析装置和cnv检测分析装置。

11、在其中一个实施例中，所述snv与indel检测分析装置包括第一数据获取模块、第一比对模块和第一变异分析模块；所述第一数据获取模块用于获取待测样本的测序数据，所述测序数据为使用预设探针杂交捕获后得到的测序数据；所述第一比对模块用于将所述待测样本的测序数据与人类参考基因组进行比对；所述第一变异分析模块用于根据比对结果得到关于待测样本的snv和indel变异结果。

12、在其中一个实施例中，所述cnv检测分析装置包括第二数据获取模块、窗口划分模块、第二比对模块和第二变异分析模块。

13、所述第二数据获取模块用于分别获取待测样本的测序数据和对照样本的测序数据，所述测序数据为使用预设探针杂交捕获后得到的包含靶标区域和非靶标区域的测序数据。

14、所述窗口划分模块用于分别将所述待测样本的测序数据和所述对照样本的测序数据进行窗口划分，其中，靶标区域按照90bp～200bp的长度进行窗口划分，非靶标区域按照25kb～35kb的窗口进行划分。

15、所述第二比对模块用于将所述待测样本的测序数据和所述对照样本的测序数据进行比对，获得待测样本各窗口的log2ratio值。

16、所述第二变异分析模块用于根据所述log2ratio值鉴别待测样本的cnv变异结果。

17、在其中一个实施例中，所述预设探针覆盖的区域为chrx:31137039-33357605，参考grch37.p13版本；探针的长度为90bp～120bp；探针的gc含量为45％～55％；探针密度根据探针杂交捕获区域的gc含量确定：对于gc含量为40％～60％的探针杂交捕获区域，所述探针密度为0.5～1.5；对于gc含量为30％～39％和61％～70％的探针杂交捕获区域，所述探针密度为1～6；对于gc含量为15％～29％和71％～80％的探针杂交捕获区域，所述探针密度为4～24。

18、在其中一个实施例中，所述预设探针包括序列分别如seq id no.1～seq idno.43所示的rna探针或其对应的dna探针。

19、在其中一个实施例中，所述第二比对模块用于分别获取各窗口待测样本的reads数目r1与对照样本的reads数目r2，根据r1和r2分别计算各窗口待测样本的平均测序深度x和对照样本的平均测序深度y，log2(x/y)即所述的log2ratio值。

20、在其中一个实施例中，所述第二变异分析模块还包括窗口合并模块和变异鉴别模块。

21、在其中一个实施例中，所述窗口合并模块用于根据待测样本各窗口的log2ratio值分析待测样本各窗口的cnv变异类型，并合并待测样本中cnv变异类型相同且其间隔的长度小于1000bp的相邻窗口。

22、在其中一个实施例中，所述变异鉴别模块用于根据合并的各窗口cnv变异类型鉴别待测样本的cnv变异结果。

23、本技术的第三个方面，提供了一种计算机设备，具有处理器和存储器，所述存储器存储有计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时实现检测dmd基因变异的分析方法的步骤。

24、本技术的第四个方面，提供了一种计算机存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被执行时实现检测dmd基因变异的方法的步骤。

25、本技术的第五个方面，提供了一种计算机程序产品，包括计算机程序，该计算机程序被处理器执行时实现检测dmd基因变异的方法的步骤。

26、本技术的第六个方面，提供了一种用于检测dmd基因变异的探针，所述探针覆盖的区域为chrx:31137039-33357605，参考grch37.p13版本；探针的长度为90bp～120bp；探针的gc含量为45％～55％；探针密度根据探针杂交捕获区域的gc含量确定：对于gc含量为40％～60％的探针杂交捕获区域，所述探针密度为0.5～1.5；对于gc含量为30％～39％和61％～70％的探针杂交捕获区域，所述探针密度为1～6；对于gc含量为15％～29％和71％～80％的探针杂交捕获区域，所述探针密度为4～24。

27、在其中一个实施例中，所述探针片段的序列包括如seq id no.1～seq id no.43所示的rna探针或其对应的dna探针。

28、本技术的第七个方面，提供了一种检测dmd基因变异的试剂盒，包括所述的探针；

29、所述试剂盒还包括磁珠、乙醇和杂交预混液中的一种或者多种。

30、与传统的技术相比，本技术还包括如下有益效果：

31、本技术提供了一种的检测dmd基因变异的方法，包括对待测样本同时进行snv、indel和cnv检测分析。通过本技术的检测dmd基因变异的方法，可以确保目标区域捕获的均一性，极大的提高了snv和indel检出的全面性，以及片段缺失和重复检出的灵敏度(单个外显子水平)。使用本技术的探针进行检测时，仅需要一次实验，就能够一体化高效检测dmd基因上发生的cnv、snv和indel，具有检测全面、高效、灵敏度高、准确性好的优点，可用于携带者筛查和产前诊断等方向，阻止dmd患儿出生，降低其出生缺陷，有利于在临床实践中推广应用。