快速检测二代测序DNA聚合酶活性的方法和试剂盒与流程

本发明属于生物，涉及基因测序技术，具体是涉及一种快速检测二代测序dna聚合酶活性的方法和试剂盒。

背景技术：

1、dna聚合酶，又称dna依赖的dna聚合酶(dna—dependent dna polymerase，dnapol)，它是以亲代dna为模板，催化底物dntp分子聚合形成子代dna的一类酶。此酶最早是美国科学家arthur komberg于1957年在大肠杆菌中发现的，被称为dna聚合酶ⅰ(dnapolymeraseⅰ，简称polⅰ)以后陆续在其他原核生物及真核生物中找到了多种dna聚合酶。这些dna聚合酶的共同特征为：①具有5’→3’聚合酶活性，这就决定了dna只能沿着5’→3’方向合成。

2、随着测序技术的不断发展，目前市场上存在一代、二代、三代多种测序技术平台，而其中二代测序平台以其通量高、准确性高、成本相对较低的特点成为市场上商业化最为成功的测序平台。生产二代测序平台的代表公司有illumina和深圳华大智造，两家公司的二代测序技术都是通过在碱基上修饰荧光基团，然后在测序过程中利用dna聚合酶聚合带荧光的碱基(dntp)，从而通过荧光成像的方法去识别出每个碱基的信息达到测序的目的。由于测序过程使用的荧光dntp底物与常规pcr技术所使用的dntp底物有一定的区别，因此二代测序过程使用的dna聚合酶也与pcr使用的酶有一定区别，往往需要对一些聚合酶进行改造，而检测dna聚合酶活性，筛选出适合聚合以及能快速聚合带荧光碱基底物的dna聚合酶是二代测序技术中较为关键的一环。

3、现有技术往往通过直接在测序平台上进行测序来检测dna聚合酶的活性，检测通量低，一次往往只能检测1-2种聚合酶，而且时间较长，大约需要8-24h，成本较高。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的在于提供一种快速检测二代测序dna聚合酶活性的方法和试剂盒，所述检测方法不但能够很好地检测dna聚合酶活性以及对不同碱基的偏好性，还可以一次性提高检测的dna聚合酶的数量，减少检测时间，同时相对于测序的检测手段来说成本显著降低。

2、实现上述目的的技术方案包括如下。

3、本发明的第一个方面，是提供一种快速检测二代测序dna聚合酶活性的方法，包括以下步骤：s1.获得至少一种荧光引物，所述荧光引物的在退火之后形成茎环结构，茎环结构之外，其5’末端突出一个未配对的碱基，所述未配对的碱基选自a、c、g、t种任一种；所述荧光引物的5’末端修饰了荧光淬灭基团；

4、s2.将待检测的dna聚合酶、所述荧光引物、至少一种荧光基团标记碱基底物(dntp)混合至一起构成检测体系，进行聚合反应，并同时进行荧光检测，所述碱基底物选自dttp、dctp、datp、dgtp，且相应地与所述荧光引物的未配对的碱基能够配对。

5、在其中一些实施例中，所述荧光引物的碱基长度为39-51，更优选为41-47。

6、在其中一些实施例中，所述二代测序dna聚合酶是对带有修饰基团的非天然dntp具有聚合活性的聚合酶，包括kod聚合酶、9n聚合酶及其相应突变体，以及其他潜在的突变之后对非天然dntp具有聚合活性的聚合酶关酶(例如9n(exo-)dna polymerase)。

7、在其中一些实施例中，所述检测仪器是能提供聚合反应，且扫描样本在不同时间点的荧光信号，且同时能扫描多个样本的设备，优选为酶标仪。

8、在其中一些实施例中，所述荧光检测的时间为15-30min。

9、在其中一些实施例中，所述荧光引物在检测体系中的浓度为1.5μm-2.5μm，更优选为1.8μm-2.2μm，进一步优选为1.9μm-2.1μm。

10、在其中一些实施例中，所述碱基底物在检测体系中的浓度为0.6μm-1.5μm,更优选为0.8μm-1.2μm，进一步优选为0.8μm-1.0μm。

11、在其中一些实施例中，荧光基团最常用的比如fam(carboxy-fluorescein，羧基荧光素)、tet(tetrachloro fluorescein，四氯-6-羧基荧光素)、hex(hexachlorofluorescein，六氯-6-甲基荧光素)、vic、5-tamra(carboxytetramethylrhodamine，羧基四甲基罗丹明)、rox(x-rhodamine，罗丹明x)、texas red-x(德克萨斯红)、cy3(indodicarbocyanine 3，吲哚菁类染料3)、cy5(indodicarbocyanine 5，吲哚菁类染料5)、joe(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)。

12、在其中一些实施例中，荧光淬灭基团最常用的比如bhq(black hole quencher)系列，dabcyl(4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸)、eclipse等。

13、本发明的第二个方面，是提供一种快速检测二代测序dna聚合酶活性的试剂盒，所述试剂盒包括：至少一种荧光引物，所述荧光引物的组成为在退火之后形成的茎环结构和5’末端突出一个未配对的碱基，所述未配对的碱基选自a、c、g、t种任一种，所述荧光引物的5’末端修饰了荧光淬灭；和

14、至少一种荧光标记碱基底物，所述碱基底物为dttp、dctp、datp、dgtp中的任一种。

15、在其中一些实施例中，所述荧光引物包括4种不同的5’末端突出一个未配对的碱基，分别为a、c、g、t碱基。

16、在其中一些实施例中，所述碱基底物为dttp、dctp、datp、和dgtp(dntp)。

17、在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括酶标板。

18、本发明所述检测二代测序dna聚合酶活性的方法，通过通过能够形成茎环结构的引物序列，引物5’末端的位置带有突出的选自a、c、g、t的一种碱基和荧光淬灭基团，待测dna聚合酶聚合测序用荧光碱基底物来检测dna聚合酶对测序dntp的活性，荧光淬灭基团对聚合上引物的dntp的荧光基团具有淬灭效应的方式检测聚合酶活性和对不同碱基的偏好性。

19、本发明所述检测二代测序dna聚合酶活性的方法与现有通过测序的方式检测测序用聚合酶活性的方法相比，具有检测通量更高的优点，在酶标仪上即可进行检测，使用酶标仪的孔板检测时可以根据孔板大小以及检测样品的数量同时检测8-384种dna聚合酶的活性，且大大缩短了检测活性所需要的时间，本发明所述方法在检测多种dna聚合酶同时进行，可在20-30min内即可获得相应的检测结果。

技术特征：

1.一种快速检测二代测序dna聚合酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.获得至少一种荧光引物，所述荧光引物的在退火之后形成茎环结构，茎环结构之外，其5’末端突出一个未配对的碱基，所述未配对的碱基选自a、c、g、t种任一种；所述荧光引物的5’末端修饰了荧光淬灭基团；

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述荧光引物的碱基长度为39-51，更优选为41-47。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述二代测序dna聚合酶是对带有修饰基团的非天然dntp具有聚合活性的聚合酶，优选地，包括kod聚合酶、9n聚合酶及其相应突变体。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述荧光检测的时间为15-30min。

5.根据权利要求1-4任一项所述方法，其特征在于，所述荧光引物在检测体系中的浓度为1.5μm-2.5μm，更优选为1.8μm-2.2μm，进一步优选为1.9μm-2.1μm。

6.根据权利要求1-4任一项所述方法，其特征在于，所述碱基底物在检测体系中的浓度为0.6μm-1.5μm,更优选为0.8μm-1.2μm，进一步优选为0.8μm-1.0μm。

7.根据权利要求1-4任一项所述方法，其特征在于，荧光基团是选自羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、vic、羧基四甲基罗丹明、罗丹明x、德克萨斯红、吲哚菁类染料3、吲哚菁类染料5、2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素；和/或所述荧光淬灭基团选自bhq系列，4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸、eclipse。

8.一种快速检测二代测序dna聚合酶活性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：至少一种荧光引物，所述荧光引物的组成为在退火之后形成的茎环结构和5’末端突出一个未配对的碱基，所述未配对的碱基选自a、c、g、t种任一种，所述荧光引物的5’末端修饰了荧光淬灭；和

9.根据权利要求8所述的快速检测二代测序dna聚合酶活性的试剂盒，其特征在于，所述碱基底物有dttp、dctp、datp、和dgtp四种。

10.根据权利要求8或9所述的快速检测二代测序dna聚合酶活性的试剂盒，其特征在于，所述荧光引物包括4种不同的5’末端突出一个未配对的碱基，分别为a、c、g、t碱基。

技术总结
本发明涉及一种快速检测二代测序DNA聚合酶活性的方法和试剂盒，所述检测方法：获得至少一种荧光引物，其在退火之后形成茎环结构，且其5’末端突出一个未配对的碱基，所述未配对的碱基选自A、C、G、T种任一种；将待检测的DNA聚合酶、所述荧光引物、至少一种荧光基团标记碱基底物混合，进行聚合反应，并同时进行荧光检测，所述碱基底物选自dTTP、dCTP、dATP、dGTP，且相应地与所述荧光引物的未配对的碱基能够配对。本发明所述检测二代测序DNA聚合酶活性的方法具有检测通量更高的优点，荧光淬灭基团对聚合上引物的dNTP的荧光基团具有淬灭效应的方式检测聚合酶活性和对不同碱基的偏好性，可同步同时检测多种DNA聚合酶的活性，大大缩短了检测时间。

技术研发人员：傅德丰,王谷丰,刘二凯,赵陆洋
受保护的技术使用者：深圳赛陆医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16