一种具有高耐受性的乳酸菌的制备方法及应用

本发明属于乳酸菌的制备，尤其涉及一种具有高耐受性的乳酸菌的制备方法及应用。

背景技术：

1、乳酸菌(lactic acid bacteria，lab)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性，至少包含18个属，共200多种。其中绝大部分都是人体内必不可少的、且具有重要生理功能的菌群，广泛存在于人体的肠道中。乳酸菌不仅是研究肠道菌群、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域具有极高的应用价值。然而，现有制备方法制备的乳酸菌菌种，在人体内的存活率低。这意味着，即使乳酸菌被人体摄取，也可能在到达肠道等需要它们的地方之前就死亡，从而降低了这些菌种的效用。；同时，乳酸菌在当前使用的培养基中繁殖效果差。这可能会影响乳酸菌的大规模生产和使用，因为无法有效、迅速地繁殖足够的菌种来满足工业、医药和食品等领域的需求。

2、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

3、(1)现有在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌的制备方法制备的乳酸菌菌种保藏活率低。

4、(2)现有培养基培养乳酸菌繁殖效果差。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种具有高耐受性的乳酸菌的制备方法及应用。

2、本发明是这样实现的，一种具有高耐受性的乳酸菌的制备方法，其特征在于，包括：

3、步骤一，获取乳酸菌菌种，并利用人工智能模型来预测最佳的保藏条件，包括最适的温度、湿度和保藏时间，将乳酸菌菌种进行冷冻干燥保藏；将乳酸菌菌种接种于培养基中，培养基添加多糖、氨基酸，维持菌种的活性；

4、步骤二，选择优势的菌丝作为母种，接于培养基的摇瓶中，26℃下静置50h，接着将静置后的摇瓶放至23℃的恒温摇床，震荡培养62h，获得发酵液；将发酵液进行离心得到菌体，将得到的菌体进行消化系统应激处理，得到经消化系统应激处理后的菌体；

5、步骤三，利用机器学习模型预测最适的稀释比例，并将经消化系统应激处理后的菌体稀释并涂布于平板上进行培养，筛选典型菌落；在筛选过程中，使用含有不同压力的培养基选择性地筛选出更具耐受性的菌落，将得到的典型菌落重复以上步骤的操作，得到在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌；

6、步骤四，采用深度学习算法对得到的具有高耐受性的乳酸菌进行全基因组测序，建立其基因表达模型，研究乳酸菌在不同环境压力下的生存机制，进一步改良和优化乳酸菌菌种。

7、进一步，所述应激处理通过模拟人体消化系统的环境进行，具体为：

8、将菌体暴露于ph值为2的酸性溶液中，模拟胃液的环境，生存下来的菌种经过这种高酸性环境的应激，一部分会产生一些抗酸性的机制；将上述经过酸性应激处理的菌体，暴露于含有0.3％胆汁盐的溶液中，测试抗胆汁盐的能力；将经过上述应激处理的菌体在培养基上进行培养，筛选出在这些压力环境中能够生存的菌体。

9、进一步，所述将乳酸菌菌种进行保藏方法如下：

10、(1)将产枯草芽孢杆菌接种入添加了正己烷的发酵培养基中进行发酵培养；发酵培养期间进一步添加正己烷；收集发酵培养物中的γ-聚谷氨酸；配制γ-聚谷氨酸溶液，将γ-聚谷氨酸溶液加入到甘油中，混合均匀制成γ-聚谷氨酸-甘油混合溶液，灭菌备用；

11、(2)将脱脂棉制作棉球，并将其置于玻璃培养皿中，玻璃培养皿外用铝箔纸或牛皮纸包裹，灭菌备用；培养待保藏的乳酸菌菌种，得到乳酸菌菌种液；

12、(3)用无菌镊子夹取制备的无菌棉球浸入培养好的乳酸菌种液中，使棉球吸附充足，然后将吸附有菌液的棉球置于离心管中，再用无菌注射器注入配制的γ-聚谷氨酸-甘油混合液至装满离心管，得到待保藏样品；将得到的待保藏样品低温保藏。

13、进一步，所述γ-聚谷氨酸溶液中γ-聚谷氨酸的重量百分比为6％；

14、γ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中γ-聚谷氨酸溶液与甘油的体积比为26：70；

15、配置的γ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中还加入了质量比为3:2的精氨酸和苯丙氨酸。

16、进一步，所述棉球的直径为6mm。

17、进一步，所述的培养时间为5-7小时，对数生长期。

18、进一步，所述培养基制备方法如下：

19、1)称取250g鲜嫩玉米粒用水冲洗后，放入300ml亚硫酸溶液中，浸泡得到浸泡后的玉米，将浸泡后的玉米放在榨汁机中鲜榨后过滤，去除滤渣得到玉米汁；将玉米汁倒入烧杯中，加热升温，保温，再冷却至室温，搅拌后得到玉米浆；称取150g番茄、50g柠檬、葡萄糖60g，放入榨汁机鲜榨，过滤去除滤饼得到番茄柠檬汁；

20、2)向发酵罐中加入160g切碎的马铃薯块，12g酵母膏、牛肉浸膏13g、胰蛋白胨15g，密封静置，发酵后，过滤去除发酵滤渣得到马铃薯发酵液；按重量份数计，向高速分散机中加入45份玉米浆、26份番茄柠檬汁、50份马铃薯发酵液，搅拌，得到分散营养液；

21、3)按重量份数计，向培养皿中加入52份分散营养液、2份无水磷酸氢二钾、34份蛋白胨、4份硫酸铵，搅拌混合后，将培养皿放入高压蒸汽中灭菌，得到培养基。

22、进一步，所述洗涤次数6次，亚硫酸溶液质量分数为26％，浸泡玉米的时间为6h，鲜榨时间为26min。

23、进一步，所述加热升温后的温度为110℃，保温时间为11min，搅拌时间为3min，鲜榨时间为16min。

24、进一步，所述搅拌转速为1600r/min，搅拌时间为50min。

25、进一步，所述搅拌混合时间为11min，高压蒸汽温度为135℃、压强为0.11mpa，杀菌时间为13min。

26、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

27、(1)通过使用人工智能和机器学习模型预测最佳的菌种保藏条件和培养基优化方案，可以有效提高乳酸菌的存活率和繁殖效果。这使得乳酸菌能在不利的环境中存活，同时也能在有利的环境中快速繁殖，发挥更大的作用。

28、(2)通过模拟人体消化系统的环境并结合机器学习模型进行筛选，我们可以获得具有高耐受性的乳酸菌菌种。这种乳酸菌菌种能更好地适应人体的消化系统环境，从而在人体内发挥更大的益生效果。

29、(3)利用深度学习算法进行全基因组测序和基因表达模型的建立，可以深化我们对乳酸菌的理解，揭示其在不同环境压力下的生存机制，为进一步改良和优化乳酸菌菌种提供重要的理论支持。

30、(4)人工智能和机器学习可以根据实验数据预测最优的生产流程，提高生产效率，同时也可以降低不必要的试错成本，提高生产效率。

31、本发明通过将乳酸菌菌种进行保藏方法操作简单，成本低廉，保藏期可达10-15年，菌种存活率高可达90以上；通过控制γ-聚谷氨酸与甘油的体积比，使制备的保护液更适于乳酸菌菌种的生存，从而可以更好的保证乳酸菌菌种的存活率，使乳酸菌菌种保存15年，存活率依然在90％以上，并且保藏后的菌种稳定性好，活性高；同时，通过培养基制备方法制备的培养基的碳源主要来源于马铃薯发酵液，酵母菌群能摧毁植物细胞壁，将纤维素、果胶质降解为单糖和寡糖，并生成多种有机酸、维生素、生物酶、未知生长因子，这大大提高了营养成分含量，玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白，对乳酸菌菌种是易吸收的氮源，随着繁殖浓度增加，乳酸含量增加，玉米浆中一些木质纤维也被分解为可吸收的碳源，因而培养基对繁殖有利。