一种维生素B12核糖开关突变体及高通量检测维生素B12的方法

本发明涉及一种维生素b12核糖开关突变体及高通量检测维生素b12的方法，属于生物。

背景技术：

1、核糖开关是一种位于mrna特定区域的分子，其通过感知代谢物浓度的变化调控目标基因的表达。核糖开关由适体(aptamer domain)域和表达平台(expression platform)两部分组成，适体域能折叠成多维结构，感知目标代谢物浓度的变化，并特异性的结合目标代谢物，表达平台位于适体域的下游，通常和适体域具有一定的重叠。当目标代谢物与适体域相结合后，表达平台的rna空间结构发生改变，调控基因表达。核糖体开关具有响应时间短、代谢负担小、特异性高等特点，已经被用于细菌代谢工程。

2、维生素b12(vitamin b12)，又名钴胺素，是一类对动物具有生物活性的类咕啉同功维生素的总称。其中，氰钴胺(c63h88con14o14p)是我们通过食物与营养补充的维生素b12的主要形式。羟钴胺(c62h89con13o15p)用于治疗维生素缺乏症，也用于治疗氰化物中毒。甲钴胺(c63h91con13o14p)为内源性维生素b12，其对神经元的传导作用良好，可通过甲基转换反应促进核酸-蛋白-脂肪代谢，其作为甲硫氨酸合成酶的辅酶，可使高半胱氨酸转化为甲硫氨酸，参与脱氧核苷合成胸腺嘧啶过程，可促进核酸、蛋白合成，促进轴索内输送和轴索再生及髓鞘的形成，修复被损害的神经组织。腺苷钴胺(c72h100con18o17p)是一种维生素b12辅酶，主要用于巨幼红细胞性贫血、营养不良性贫血、妊娠期贫血，亦用于多发性神经炎、神经根炎、营养性神经疾患等神经性疾患以及放射线和药物引起的白细胞减少症。

3、微生物合成维生素b12可产生不同类型的维生素b12，而维生素b12目前大多依赖hplc等检测方法，其成本高、耗时长、环境不友好，难以广泛应用于维生素b12的高通量检测。尽管目前有可识别氰钴胺等维生素b12的核糖开关，但这些核糖开关的特异性强，仅能检测一种核糖开关。因此，快速检测胞内合成的多种类型维生素的含量成为亟待解决的问题。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种维生素b12核糖开关突变体及基于其的一种对多种类型维生素b12进行快速检测的方法，尤其是该核糖开关突变体与荧光蛋白序列结合，可根据氰钴胺、羟钴胺、甲钴胺和腺苷钴胺的含量不同产生不同强度的荧光响应，解决了现有维生素b12检测困难的问题，有利于实现维生素b12的高通量检测。

2、本发明的第一个目的是提供一种维生素b12核糖开关突变体，其核苷酸序列如seqid no.2所示。具体如下：

3、gtcaaataggtgccggtccgtgaacaacagccggcttaaaagggacaccggtaaaagccggtgaggtcccgccactgtacttggcgccaagagccaggatacctgcctgtttgatcagcacgaattctgcgaggacagatgatgtgt。

4、本发明的第二个目的是提供上述维生素b12核糖开关突变体在基因表达调控中的应用。

5、本发明的第三个目的是提供上述维生素b12核糖开关突变体在维生素b12合成菌株的高通量筛选中的应用。

6、进一步地，所述维生素b12核糖开关突变体下游连接识别标记编码基因。

7、进一步地，用于不同维生素b12的单一检测或混合检测。

8、进一步地，所述维生素b12包括氰钴胺、羟钴胺、甲钴胺、腺苷钴胺中的一种或几种。

9、本发明的第四个目的是提供一种检测维生素b12的方法，包括以下步骤：

10、s1、将编码识别标记的基因连接在核苷酸序列如seq id no.2所示的核糖开关下游，获得重组质粒；

11、s2、将含有所述重组质粒的重组菌与待检测体系共孵育或将所述重组质粒导入待检测菌株中，通过识别标记实现维生素b12的检测。

12、进一步地，所述识别标记包括但不限于荧光蛋白、抗性基因等，本发明的一个实施例中选用绿色荧光蛋白进行测试。

13、进一步地，所述核糖开关与编码识别标记的基因由诱导型启动子调控表达。

14、进一步地，检测体系中含有诱导剂。

15、进一步地，所述重组菌的宿主或待检测菌株包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。

16、进一步地，所述维生素b12包括氰钴胺、羟钴胺、甲钴胺、腺苷钴胺中的一种或几种。

17、本发明的有益效果：

18、本发明构建了响应维生素b12浓度的人工核糖开关突变体并将该核糖开关的下游连接荧光蛋白基因，将维生素b12的浓度转换为可视化、易检测的荧光强度。利用本发明，不仅可以对氰钴胺、羟钴胺、甲钴胺、腺苷钴胺的浓度进行快速地单一检测，还可以对不同类型的维生素b12进行快速地同时检测，具有非常高的应用潜力。

技术特征：

1.一种维生素b12核糖开关突变体，其特征在于：所述维生素b12核糖开关突变体的核苷酸序列如seq id no.2所示。

2.权利要求1所述维生素b12核糖开关突变体在基因表达调控中的应用。

3.权利要求1所述维生素b12核糖开关突变体在维生素b12合成菌株的高通量筛选中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述维生素b12核糖开关突变体下游连接识别标记编码基因。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：用于不同维生素b12的单一检测或混合检测。

6.一种检测维生素b12的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述识别标记包括荧光蛋白、抗性基因中的至少一种。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述核糖开关与编码识别标记的基因由诱导型启动子调控表达。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述重组菌的宿主或待检测菌株包括大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述维生素b12包括氰钴胺、羟钴胺、甲钴胺、腺苷钴胺中的一种或几种。

技术总结
本发明公开了一种维生素B12核糖开关突变体及高通量检测维生素B12的方法，属于生物技术领域。本发明基于一种广泛响应维生素B12类化学物的核糖开关突变体构建了高通量检测维生素B12的方法，将维生素B12的浓度转换为可视化、易检测的荧光强度。利用本发明，不仅可以对氰钴胺、羟钴胺、甲钴胺、腺苷钴胺的浓度进行快速地单一检测，还可以对不同类型的维生素B12进行快速地同时检测，具有非常高的应用潜力。

技术研发人员：夏小乐,刘喜荣,徐文照,蔡永超,冯静,曾春玲,谢斯思,高玲,罗意
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15