丁香假单胞菌噬菌体及其应用的制作方法

本公开属于微生物领域及生物防治领域，具体涉及一株丁香假单胞菌噬菌体及其应用。

背景技术：

1、植物细菌性疾病目前在全球范围内严重作物种植产业，对这类病原菌的防治往往局限在使用抗生素或化学农药，但容易产生具有耐药性的新的病原菌。

2、噬菌体是一类细菌病毒的总称，可特异性裂解宿主菌，但对非靶向的细菌和动植物无毒，不会破坏微生物的多样性，满足当代提倡的绿色无公害农业要求。因此，噬菌体疗法在细菌性病害的生物防治中具有巨大潜力。目前噬菌体已经在人类疾病、水产动物疾病及植物病害中有少量应用。但应用噬菌体制剂防治由丁香假单胞菌引起的植物病害还较为欠缺。该噬菌体的开发不仅积极配合我国农药减量的战略目标，还能够有效推动相关种植产业绿色可持续发展。

技术实现思路

1、本公开提供了一种能够有效杀灭丁香假单胞菌而可应用于植物病害特别是猕猴桃溃疡病生物防治的噬菌体。本公开的丁香假单胞菌噬菌体能够高效杀灭植物体内及果园环境中的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种，具有裂解量大、潜伏期短等特点，在植物病害特别是猕猴桃溃疡病的生物防治中有较好的应用前景。其易于制备喷洒液或淋洗液，能够广泛应用于农药添加剂、消毒剂和清洁剂等。

2、本公开的一方面提供了一种丁香假单胞菌噬菌体，所述丁香假单胞菌噬菌体为丁香假单胞菌噬菌体phi 6(pseudomonas phage phi6)，于2020年7月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为cgmcc 18919。

3、在一些实施方式中，所述丁香假单胞菌噬菌体为rna噬菌体。

4、在一些实施方式中，所述丁香假单胞菌噬菌体具有seq id no:1所示的表面蛋白基因。

5、本公开的丁香假单胞菌噬菌体在固体培养基上可以产生边缘清晰的透亮空斑，周围无晕环，培养18h后直径为2～4mm；经透射电子显微镜观察发现，该丁香假单胞菌噬菌体具有典型的球状结构，直径约80～100nm，经鉴定该丁香假单胞菌噬菌体属囊状噬菌体科，假单胞菌噬菌体phi 6。

6、在一些实施方式中，所述丁香假单胞菌噬菌体的感染复数为0.1，效价达到109pfu/ml，具有较好的扩繁性能。

7、在一些实施方式中，所述丁香假单胞菌噬菌体的潜伏期约为30min，爆发期约为45min，与同类噬菌体相比具有潜伏期短，爆发量大的优势。

8、在一些实施方式中，所述丁香假单胞菌噬菌体在ph 6-9的环境下活性较为稳定。

9、在一些实施方式中，所述丁香假单胞菌噬菌体在40℃以下的温度下活性较为稳定。

10、本公开提供的上述丁香假单胞菌噬菌体是从土壤环境中分离得到的一株新的噬菌体，能够特异地感染并裂解丁香假单胞菌猕猴桃致病变种，而不会杀死其他细菌，对正常菌群不会造成额外影响。噬菌体作为细菌病毒，不受细菌耐药性影响，在应用中也不引起药物残留等问题，具有安全性高和环境友好的特点。相比其他噬菌体，本公开的噬菌体的潜伏期明显更短，有利于噬菌体进入植物环境后更快速地裂解病原菌从而控制疾病的进程。而45min的短爆发期可以使本公开的噬菌体在较短时间内完成更多次对病原菌的裂解，有效降低病原菌的密度，控制疾病，在猕猴桃溃疡病的生物防治中具有很好的应用前景。

11、本公开的另一方面提供了一种生物制剂，其包括上述丁香假单胞菌噬菌体，作为生物制剂的活性成分。

12、在一些实施方式中，所述生物制剂可以是农业杀菌剂、消毒剂、清洁剂或其添加剂等。

13、在一些实施方式中，所述生物制剂可以是单一制剂，或复配制剂。作为优选，所述生物制剂是已纯化的丁香假单胞菌噬菌体制备的单一制剂，或是以纯化丁香假单胞菌噬菌体为主要成分制备的复配制剂，例如为抑制丁香假单胞菌污染的多种产品的主要成分，包括农药添加剂、果园消毒剂和农具清洁剂等。

14、在一些实施方式中，所述生物制剂的剂型可以是液体制剂，或冻干制剂。在一些实施方式中，所述生物制剂可以采取溶液、混悬液、乳液、粉末、片剂、喷雾剂、注射剂等的形式。

15、在一些实施方式中，所述生物制剂还包括添加剂成分，例如稀释剂、辅药、表面活性剂、赋形剂、媒介物、分散剂、稳定剂、填料和溶剂等，具体使用的载体成分可以由本领域技术人员结合本公开以及实际的应用领域以及本领域常识进行确定。

16、本公开的又一方面提供了上述的丁香假单胞菌噬菌体或上述的生物制剂在防治丁香假单胞菌及其猕猴桃致病变种(pseudomonas syringae pv.actinidiae，psa)所致植物病害中的应用。

17、在一些具体实施方式中，所述丁香假单胞菌猕猴桃致病变种可以为psabj530(cgmcc1.19157)或丁香假单胞菌atcc 21781、atcc 19310、atcc 49211等。

18、在一些实施方式中，所述植物病害是丁香假单胞菌引起的细菌性疾病，例如为猕猴桃溃疡病、黄瓜细菌性角斑病、番茄细菌叶斑病、菜豆晕疫病和/或烟草野火病。在一些具体实施方式中，所述植物病害是猕猴桃溃疡病。

19、本公开的丁香假单胞菌噬菌体对丁香假单胞菌或丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(psa)有良好的裂解效果。该丁香假单胞菌噬菌体能够在显著降低植物体内病原菌浓度，治疗效果优于已报道的同类噬菌体，说明该丁香假单胞菌噬菌体可有效杀灭丁香假单胞菌致病菌，对其引起的植物病害具有较好的防治功能。

20、本公开的又一方面还提供了一种防治丁香假单胞菌所致植物病害的方法，其包括采用所述生物制剂对植物进行处理。

21、在一些实施方式中，所述处理包括对植物表面喷洒所述生物制剂。

22、在一些具体实施方式中，所述生物制剂为农业杀菌剂，所述处理包括将所述农业杀菌剂喷洒于猕猴桃叶面，用于防治猕猴桃溃疡病。

23、在一些实施方式中，所述处理包括将所述生物制剂注射于植物体内，例如以打吊瓶的方式注入植物体内。

24、本公开的又一方面还提供了一种防治果园环境中丁香假单胞菌的污染的方法，其包括采用所述生物制剂对果园环境进行处理。

25、在一些实施方式中，所述处理包括对环境表面喷洒所述生物制剂，或将所述生物制剂注射于植物体内。

26、在一些实施方式中，所述生物制剂为消毒剂或清洁剂，将所述消毒剂或清洁剂喷洒于果园环境，例如喷洒于植物表面、种植土壤、果园空气及地表水、农用器具等，或以打吊瓶的方式注入植物体内。

27、本公开的丁香假单胞菌噬菌体土壤消毒实验证实了使用106pfu/ml浓度的丁香假单胞菌噬菌体可有效的杀灭土壤环境中污染的宿主菌。

28、本公开的又一方面提供了一种试剂盒，其包括上述丁香假单胞菌噬菌体。

29、在一些实施方式中，所述试剂盒用于丁香假单胞菌的快速检测或对临床样本中的目标致病菌筛选。

30、本发明的丁香假单胞菌噬菌体可以应用于丁香假单胞菌的快速检测，包括但不限于以试纸、试纸盒等形式对丁香假单胞菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，有效确保检测的灵敏度。

31、本公开提供了一株新发现的丁香假单胞菌噬菌体，能够高效杀灭植物体内及果园环境中的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种，具有裂解量大、潜伏期短等特点，在猕猴桃溃疡病的生物防治中有较好的应用前景。其易于制备喷洒液或淋洗液，能够广泛应用于农药添加剂、消毒剂和清洁剂等。该噬菌体可制备成单一制剂使用，也具有与其他噬菌体复配制成噬菌体鸡尾酒的应用潜力。

32、生物材料保藏信息：

33、本公开的丁香假单胞菌噬菌体cxp15，于2020年7月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称为cgmcc)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。其保藏编号为cgmcc 18919，分类命名为假单胞菌噬菌体phi6(pseudomonasphage phi6)。