一种高效快速获得目的抗体的方法与流程

本发明属于生物，涉及抗体的获得，尤其涉及一种一种高效快速获得目的抗体的方法。

背景技术：

1、抗体是机体b淋巴细胞受到抗原刺激后所产生的特异性球蛋白，故亦称为免疫球蛋白。机体初次接触抗原后，激发机体产生的特异性抗体亲和力低、持续时间短；而当同一抗原再次刺激机体后，则能产生高亲和力、高效价、持续时间长的抗体。由于抗体能与相应的抗原发生特异性结合反应，因此特异性抗体是免疫学实验中常用的试剂，不仅对于抗原的分析鉴定和定量检测极为重要，而且广泛应用于临床疾病的诊断、治疗和预防中。在免疫学检测中应用的主要抗体是多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体常用免疫动物的方法获得，而单克隆抗体则采用杂交瘤技术制备。

2、抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体，也有极少数使用提取的天然蛋白作为抗原制备特异性抗体。抗原的来源与免疫动物之间种系关系越远，其抗原免疫原性越强，越易产生免疫应答；反之，种系关系越近，则抗原免疫原性越弱。

3、体外诊断试剂原料最主要的一大来源是特异性的单克隆抗体，而优质的免疫原是获得特异性抗体的前提。除极少部分蛋白外，人体内诊断marker的自然含量普遍较低，且涉及到材料的来源问题，人体内天然蛋白的获取变得极为困难，甚至不可能。体外重组蛋白能够很好的解决蛋白获取问题，但重组蛋白同天然蛋白之间存在着一定程度的差异，这种差异往往成为后期工作的瓶颈。

4、主要存在以下缺陷：

5、1)原核表达重组蛋白缺乏有效的翻译后修饰，作为抗原使用同天然蛋白之间的差异较大。

6、2)真核表达重组蛋白接近天然蛋白，但是作为抗原使用成本太高，多数蛋白表达量较低，纯化难度较大。

7、3)天然提取蛋白仅限于体内组织中含量较高，且原料易得的极少数蛋白，作为抗原使用的应用范围受到限制。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种高效快速获得目的抗体的方法，本发明通过简单易得的方式快速获得有效的抗原，利用此类抗原快速高效获得特异性抗体，可以实现天然蛋白的方便快速获取，高难度重组蛋白的快速获得，优质抗体的顺利获得。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明提供了一种高效快速获得目的抗体的方法，所述方法包括：

4、a)选用同源蛋白作为免疫原使用，进行特异性结合纯化，得到目的抗原，进行动物免疫获得相应抗体；

5、或者：

6、b)根据目的抗体，设计合成相应的dna；提取转染量质粒dna并转染至宿主细胞，培养获得瞬时表达的细胞培养上清液，使用细胞培养上清液进行动物免疫获得目的抗体。

7、在本发明中，原核表达重组蛋白作为抗原使用同天然蛋白之间的差异较大，因此选用真核表达重组蛋白，但纯化难度大，考虑使用瞬时表达的细胞培养上清液。

8、瞬时表达的成功率同转染的质粒dna、宿主细胞的选择、转染的试剂、以及转染使用的其他条件密切相关，考虑优化转染条件，提高瞬时转染的效率并降低使用成本。

9、宿主细胞对表达的效率以及后续的培养和使用具有较大的影响，考虑使用能够悬浮培养且支持无任何动物源性培养基培养的cho-s、293f株系，包括freestylecho-s、expicho-s、expi 293f，均为细胞周期短、高效转染表达、悬浮生长、且支持无血清无动物源性培养基培养的细胞系，明显区别于常规的贴壁生长、周期较长、转染效率低下、需血清和其他成分支持的cho和hek293细胞系。

10、瞬时表达能够保证一次性使用，在瞬时转染的基础之上进行稳定株的筛选和培养，保证持续的供应。

11、作为本发明的一种优选方案，a)中，目的抗体为抗人心肌肌钙蛋白i特异性单克隆抗体。

12、作为本发明的一种优选方案，b)中，目的抗体为抗人血管内皮生长因子特异性单克隆抗体。

13、作为本发明的一种优选方案，目的抗体的具体表位为人ctni 85-90aar(laglgf)。

14、作为本发明的一种优选方案，培养所用的细胞系为cho-s细胞系和hek293细胞系。

15、作为本发明的一种优选方案，抗人血管内皮生长因子为vegf165。

16、作为本发明的一种优选方案，vegf165的序列如seq id no:1所示。

17、作为本发明的一种优选方案，选择il-6作为信号肽，载体选择pcdna3.1+，c末端添加his6-taq，进行密码子优化，得到seq id no:1所示的序列。

18、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

19、1)同源物种的蛋白质来源材料，廉价方便且易得，不存任何伦理道德问题和安全隐患；猪、牛、马等同人体内多种蛋白质具有>80％的同源性，是为替代材料的优质首选；内脏器官只需要简单的研磨匀浆配套合适的萃取液和合适的纯化手段，即可获取目的蛋白，操作过程简便；获得的目的蛋白为天然蛋白，保留了完整的天然构象和活性；同源蛋白作为免疫原获得的单克隆抗体具有很好的临床样本检测活性。

20、2)重组蛋白表达量极低，纯化十分困难，纯化蛋白免疫原性较差，使用本发明提供的瞬时表达的细胞培养上清液作为免疫原和筛选质控品使用，能够很好的解决纯化和免疫原性的问题，同时还能够增强免疫效果；瞬时表达的培养上清液作为免疫原和筛选质控品，仅需要3～7天即可获得，特殊情况下18h即可获得目的蛋白，且不必进行复杂的纯化、透析、复性、保存液调试等过程，上清液中的缓冲体系不存在检测系统的竞争和干扰。

21、3)同源蛋白，瞬时表达培养上清液都具有接近完整的天然目标蛋白的构象和性能，能够完美的模拟目标蛋白，作为免疫原使用，具有增强免疫效果的额外作用，同时具有免疫的高滴度，以及较高的细胞株得率，所得单克隆抗体具有临床样本的检测性能，较以往纯化重组蛋白所得单克隆抗体的效果更好，主要表现在优质抗体的占比更高、抗体的活性更好、检测灵敏度更高、线性范围更宽、同比检测符合度更高。

技术特征：

1.一种高效快速获得目的抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的一种高效快速获得目的抗体的方法，其特征在于，a)中，目的抗体为抗人心肌肌钙蛋白i特异性单克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的一种高效快速获得目的抗体的方法，其特征在于，b)中，目的抗体为抗人血管内皮生长因子特异性单克隆抗体。

4.根据权利要求1或2所述的一种高效快速获得目的抗体的方法，其特征在于，目的抗体的具体表位为人ctni 85-90aar。

5.根据权利要求1或3所述的一种高效快速获得目的抗体的方法，其特征在于，培养所用的细胞系为cho-s细胞系和hek293细胞系。

6.根据权利要求3所述的一种高效快速获得目的抗体的方法，其特征在于，抗人血管内皮生长因子为vegf165。

7.根据权利要求6所述的一种高效快速获得目的抗体的方法，其特征在于，vegf165的序列如seq id no:1所示。

8.根据权利要求7所述的一种高效快速获得目的抗体的方法，其特征在于，选择il-6作为信号肽，载体选择pcdna3.1+，c末端添加his6-taq，进行密码子优化，得到seq id no:1所示的序列。

技术总结
本发明公开了一种高效快速获得目的抗体的方法，包括：选用同源蛋白作为免疫原使用，进行特异性结合纯化，得到目的抗体；或者：根据目的抗体，设计合成相应的DNA；提取转染量质粒DNA并转染至宿主细胞，培养获得瞬时表达的细胞培养上清液，纯化后获得目的抗体。同源蛋白或瞬时表达培养上清液都具有接近完整的天然目标蛋白的构象和性能，能完美的模拟目标蛋白，作为免疫原使用，具有增强免疫效果的额外作用，具有免疫的高滴度，以及较高的细胞株得率，所得单克隆抗体具有临床样本的检测性能，较以往纯化重组蛋白所得单克隆抗体的效果更好，优质抗体的占比更高、抗体的活性更好、检测灵敏度更高、线性范围更宽、同比检测符合度更高。

技术研发人员：杨孝丽,李国强
受保护的技术使用者：杭州启泰生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15