一种甘薯耐低温相关蛋白IbXTH16及其相关生物材料与应用

本发明属于生物，具体涉及一种甘薯耐低温相关蛋白ibxth16及其相关生物材料与应用。

背景技术：

1、农作物低温冷害是影响中国粮食生产的重要灾害之一，并以北方地区特别是我国东北地区发生得最为频繁和严重。东北中部冷害每8年发生一次，开展作物低温冷害研究对于中国粮食安全具有重要意义。一般认为低温胁迫使植物光合作用降低、呼吸作用增强、能量产生和物质合成受阻、消耗增强、植物处于饥饿状态，严重影响了植物正常生长发育甚至导致死亡。因此，低温是限制植物生长发育的重要非生物胁迫因素之一，决定着植物的时空分布，几乎每年都会对农业生产造成巨大损失，严重影响作物的产量和品质。抗低温性已成为衡量品种是否优良的一个重要农艺性状，探索植物耐寒机制，提高其抗低温能力在农业生产上有着重要的意义。

2、由于植物耐寒性受多基因控制，利用常规育种手段往往难以达到定向改良目的，随着分子生物学技术水平的不断提高，基因工程手段越来越多的应用到植物耐寒遗传改良中。诸多耐寒基因被陆续克隆，相关耐寒分子调控机制也逐渐明确。基因工程技术因其目的性强、周期短等特点，已成为新品种选育的一条全新而有效的途径。利用转基因技术进行植物耐寒分子改良具有高效性和目的性，可弥补常规育种的不足，加速耐寒品种的选育进程，对于降低寒害造成的经济损失从而提高农作物的产量具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何调控植物抗寒性。

2、为解决上述问题，本发明提供了如下任一种蛋白质：

3、a1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

4、a2)将a1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具调控植物抗寒性的蛋白质；

5、a3)将a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

6、序列2具体如下：

7、masqlslflqllmaaclvaaamaanfnqdvqmyfgngrgkvmqggtmaaltldresgsgfqstneylfgrfdmqvklisdnsagtvttfylsslgdrhdeidfeflgnvsgqpytihtnvysqgkggreqqfhlwfdpttayhtysivwnsqriiflvdnipirvyrnhesmgvpfpknqpmrvycslwnaddwatqgglvktdwtkapftvyyrnfnidacvvsggrsscdskssadpvnnkqawqtqdvdargrnrlrwvqskhmvynycadskrfpggtfpaecknsrf。

8、上述蛋白质中，所述蛋白质的名称可为ibxth16，可来源于甘薯。

9、上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

10、上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

11、上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

12、上述蛋白质中，序列2(seq id no.2)由个292个氨基酸残基组成。

13、为结解决上述问题，本发明还提供了相关的生物材料，所述生物材料为下述任一种：

14、b1)、编码所述蛋白质的核酸分子；

15、b2)、含有b1)所述核酸分子的表达盒；

16、b3)、含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

17、b4)、含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

18、b5)、含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

19、b6)、含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有b3)所述重组载体的转基因植物组织；

20、b7)、含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有b3)所述重组载体的转基因植物器官。

21、上述生物材料中，b1)所述的核酸分子为下列任一中：

22、c1)编码链的核苷酸调控植物耐低温的核酸分子。

23、序列为序列1的dna分子(双链dna分子)；

24、c2)将c1)所述核酸分子的经过核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与c1)所示的核酸分子具有80％以上的同一性且具

25、序列1具体如下：

26、atggcatctcaactttccttattcctgcaacttcttatggcggcttgtttggtggcagccgccatggctgcaaatttcaaccaagacgttcagatgtattttggcaatggacggggtaaagtgatgcag ggcggcaccatggcagctcttactctcgacagagaatcaggttccggcttccaatccaccaacgaatatcttttcggcagatttgatatgcaggtcaagcttatctctgataactctgctggaaccgttactactttctacttatcttctctaggagacagacatgacgaaattgacttcgaattcctgggcaatgtctccggccagccttacacaatccacaccaatgtatattctcaagggaaaggaggcagggagcagcaattccatctctggttcgaccccaccaccgcctaccacacttactccattgtttggaactctcagcgcatcatcttcctcgtcgacaacattcccatcagagtttaccggaaccacgagagcatgggggtccctttccccaagaatcagcccatgagagtctactgcagcttatggaacgcagacgactgggctacgcaggggggccttgtcaagactgattggactaaggcacccttcactgtttactaccggaacttcaatattgatgcctgtgtcgtctccggcggtcggtcgtcttgcgattccaagtcgtccgccgatccggtgaacaacaaacaggcgtggcagacgcaggatgttgatgcgcgtgggaggaataggttgagatgggtgcaaagcaaacatatggtttacaattactgtgctgattccaagaggtttcctggaggtacttttcctgcagagtgcaagaactcaagattctga。

27、b1)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质ibxth16的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质ibxth16的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质ibxth16且具有蛋白质ibxth16功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

28、上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

29、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

30、上述生物材料中，b1)所述核酸分子可为所述蛋白质的编码基因。b1)所述核酸分子具体可为编码链的编码序列是序列1所示的dna分子。

31、本文中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、ti质粒或病毒载体。具体可为载体pfgc5941和/或pcambia1300-gfp和/或载体peasy-blunt simple；

32、上述生物材料中，b2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的dna，该dna不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plant physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(beachy等人(1985)embo j.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature 313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genes dev.,5:141；mogen等人(1990)plant cell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleic acids res.17:7891；joshi等人(1987)nucleic acid res.,15:9627)。

33、上述b3)中，可用植物表达载体构建含有所述基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体可为gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pgwb411、pgwb412、pgwb405、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pcambia1300-gfp、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb。使用ibxth16构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛生素基因ubiqutin启动子(pubi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

34、为解决上述技术问题，本发明还提供了蛋白质、调控所蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质的应用，所述应用为下述任一种：

35、d1)上述蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在调控植物耐寒性和/或制备调控植物耐寒性产品和/或植物育种和/或品质改良中的应用；

36、d2)上述蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在调控植物超氧化物歧化酶活性和/或制备调控植物超氧化物歧化酶活性产品和/或植物育种和/或品质改良中的应用；

37、d3)上述蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在调控植物丙二醛含量和/或制备调控植物丙二醛含量产品和/或植物育种和/或品质改良中的应用；

38、d4)上述蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在调控植物脯氨酸含量和/或制备调控植物脯氨酸含量产品和/或植物育种和/或品质改良中的应用。

39、本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质ibxth16。

40、上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

41、本发明中，所述植物育种的目的可包括培育抗寒的植物。本文中所述植物可为如下中的任一种：c1)双子叶植物或单子叶植物；c2)管状花目植物；c3)旋花科植物；c4)番薯属植物；c5)甘薯。

42、上述用途中，所述的物质调控所蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质为上述生物材料。

43、本技术中，所述调控可为上调或增强或提高或下调减少或降低。

44、上述用途具体可为上调或增强或提高所述编码基因表达的物质在上调或增强或提高植物耐寒性和/或超氧化物歧化酶活性和/或脯氨酸含量中的用途。也可为上调或增强或提高所述编码基因表达的物质在抑制或降低或下调植物丙二醛含量中的用途。

45、为解决上述技术问题，本发明还提供了调控植物耐寒性和/或超氧化物歧化酶活性和/或丙二醛含量和/或脯氨酸含量的方法，所述方法包括通过调控植物中所述蛋白质的编码基因的表达或调控植物中所述蛋白质的活性或含量，来调控耐寒性和/或超氧化物歧化酶活性和/或丙二醛含量和/或脯氨酸含量。

46、为解决上述技术问题，本发明还提供了培育高耐寒性和/或高超氧化物歧化酶活性和/或高脯氨酸含量植物的方法，包括上调或增强或提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量，得到高耐寒性和/或高超氧化物歧化酶活性和/或高脯氨酸含量的植物，所述植株的耐寒性和/或超氧化物歧化酶活性和/或脯氨酸含量植物的耐寒性和/或超氧化物歧化酶活性和/或脯氨酸含量高于所述目的植物。

47、上述方法具体可为上调或增强或提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量，得到高耐寒性植物，所述植株的耐寒性高于所述目的植物。

48、上述方法具体还可为上调或增强或提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量，得到高超氧化物歧化酶活性植物，所述植株的超氧化物歧化酶活性高于所述目的植物。

49、上述方法具体还可为上调或增强或提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量，得到高脯氨酸含量植物，所述植株的脯氨酸含量高于所述目的植物。

50、具体可为将编码上述蛋白的核酸分子转入目的植株，使所述目的植株中所述蛋白的表达量上调或增强或升高。所述核酸分子可为dna分子。

51、为解决上述技术问题，本发明还提供了培育低丙二醛含量植物的方法，包括上调或增强或提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量，得低丙二醛含量植物，所述低丙二醛含量植物中含有的丙二醛低于所述目的植物。

52、上述方法具体还可为上调或增强或提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量，得到低丙二醛含量植物，所述植株的丙二醛含量含量低于所述目的植物。

53、上述方法具体可为将编码上述蛋白的核酸分子转入目的植株，使所述目的植株中所述蛋白的表达量上调或增强或升高。所述核酸分子可为dna分子。

54、上述植物可为甘薯。也可为甘薯叶片。

55、本发明中，所述植物具体可为如下任一种：

56、c1)双子叶植物或单子叶植物；

57、c2)管状花目植物，

58、c3)旋花科植物，

59、c4)番薯属植物，

60、c5)甘薯。

61、本文中，所述抗寒性可为抗冷性。所述抗冷性为植物对冰点以上的低温的抗性。

62、本发明将ibxth16的编码基因导入甘薯中，得到过表达ibxth16基因的转ibxth16基因甘薯植株。将转ibxth16基因甘薯植株进行低温胁迫处理，发现与野生型甘薯相比，转ibxth16基因甘薯植株的sod活性增加、脯氨酸含量增加和mda含量降低。说明本发明所提供的ibxth16蛋白及其编码基因在植物对抗非生物胁迫的过程中起着重要的作用，可用于调控植物抗寒性。