羰基还原酶突变体及光学纯3-羟基四氢呋喃的制备与光学纯度测定方法

本发明属于生物催化和制药工程领域，具体涉及一种羰基还原酶突变体及光学纯3-羟基四氢呋喃的制备与光学纯度测定方法。

背景技术：

1、手性醇是众多手性药物的关键手性砌块，所以高光学纯度的手性醇制备是手性药物合成的基础。羰基还原酶被广泛应用于多种手性醇的不对称合成中，与传统的化学还原比较，具有反应条件温和、收率高、立体和区域选择性强、步骤简单、副反应少和绿色环保等优点。所以，针对目标手性醇合成的羰基还原酶的挖掘及开发是降低手性醇合成成本的重要研究方向。

2、3-羟基四氢呋喃是一种重要的手性砌块，其(s)-构型和(r)-构型分别如附图10所示。

3、其中(s)-3-羟基四氢呋喃是抗艾滋病药物安普那韦和抗癌药物阿法替尼的手性砌块，而(r)-3-羟基四氢呋喃是合成降糖药物恩格列净的关键中间体。(s)-3-羟基四氢呋喃的市场售价在190万/吨左右，具有较高的市场价值和较大的市场需求量。虽然(r)-3-羟基四氢呋喃的市场需求量不及(s)-3-羟基四氢呋喃，但其市场售价则是(s)-3-羟基四氢呋喃的4倍。目前两种构型的3-羟基四氢呋喃都主要用化学法合成。专利cn 114195743a利用(s)-1，2，4-丁三醇、甲苯和酸改性蒙脱土催化剂以一定比例在60-160℃下反应来制备(s)-3-羟基四氢呋喃。cn 104961711 a公开了一种以(r)-肉碱为起始原料，在还原剂硼氢化钠和有机溶剂四氢呋喃中进行还原、成盐反应，得到(r)-2,4-二羟基-n，n，n-三甲基丁胺盐酸盐，最后在碱性的极性溶剂中，加热至170-190℃，关环反应得到(r)-3-羟基四氢呋喃，三步总收率为62.0％，化学纯度99.1％，光学纯度99.2％。

4、虽然上述化学方法相对成熟，但是存在收率低、有毒催化剂或手性辅助试剂的添加、严苛的条件控制和大量的有机试剂回收等问题。因此，研究人员逐渐将注意力转移至生物法上。专利cn 106520714 b利用不同的乙醇脱氢酶(tbsadh)突变体分别催化50mm和30mm四氢呋喃-3-酮不对称还原制备较高光学纯度的(s)-3-羟基四氢呋喃(95％ee值)和(r)-3-羟基四氢呋喃(96％ee值)，是此前生物催化合成3-羟基四氢呋喃最高的底物载量和光学纯度。但其反应过程需额外添加昂贵的辅因子nadp+，反应时间达14～16h且其底物载量距离产业化依然具有较大的空间。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明公开了几种羰基还原酶突变体，并利用这些突变体不对称还原四氢呋喃-3-酮，实现3-羟基四氢呋喃的高效高立体选择性的制备，还公开了一种3-羟基四氢呋喃样品光学纯度的检测方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

3、一种羰基还原酶突变体，所述羰基还原酶突变体为在如seq id no.1所示的氨基酸序列上进行如下任意一种突变获得；

4、f285c/w286n；

5、c57a/f285y；

6、c57a/f285y/f113s；

7、c57a/f285y/f113t；

8、c57a/f285y/f113y；

9、c57a/f285y/l262m；

10、c57a/f285y/f113y/l262m；

11、c57a/f285y/f113y/h49l；

12、c57a/f285y/f113y/h49f；

13、c57a/f285y/f113y/h49m；

14、c57a/f285y/f113y/h49s；

15、c57a/f285y/f113y/h49i。

16、作为一种可能的实施方式，进一步，所述羰基还原酶突变体衍生于近平滑念珠菌(candida metapsilosis)来源的羰基还原酶cmcr，cmcr的氨基酸序列和核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。

17、作为一种可能的实施方式，进一步，所述羰基还原酶突变体来自于采用基因工程手段表达羰基还原酶突变体编码基因的重组表达大肠杆菌全细胞。

18、本发明提供了一种光学纯3-羟基四氢呋喃的制备方法，以四氢呋喃-3-酮为底物，将底物经上述羰基还原酶突变体不对称还原合成高光学纯度的3-羟基四氢呋喃。利用气相测定转化率以监测反应进程。

19、作为一种较优的实施方式，优选的，酶反应在磷酸盐缓冲液中进行，反应温度为25-37℃；酶反应过程中，添加异丙醇作为辅底物。

20、作为一种较优的实施方式，优选的，酶反应以羰基还原酶突变体的全细胞为催化剂。

21、作为一种可能的实施方式，进一步，上述光学纯3-羟基四氢呋喃的制备方法还包括：上述酶催化反应结束后，将反应液酸化后除去菌体和杂蛋白，清液经减压浓缩除去溶剂，获得粗品，再经硅胶柱分离，减压浓缩后，获得高光学纯度的3-羟基四氢呋喃产品。利用衍生化法结合高效液相色谱测定ee值。

22、本发明还提供了一种3-羟基四氢呋喃样品的光学纯度测定方法，包括以下步骤：

23、1)3-羟基四氢呋喃样品的衍生化：以4-硝基苯甲酰氯为衍生化试剂，在三乙胺的作用下，经反应得到相应构型的3-羟基四氢呋喃衍生物；

24、2)运用tlc技术分离样品，固定相为硅胶板hsgf254，展开剂为石油醚与乙酸乙酯的混合液，其中v石油醚：v乙酸乙酯＝4：1，紫外检测波长为254nm；

25、回收3-羟基四氢呋喃衍生物对应的条带，并用异丙醇重悬，经0.2μm滤膜过滤后进行光学纯度测定；

26、3)光学纯度测定方法：采用依力特eclassical 3100液相色谱仪进行测定，色谱柱为大赛璐od-h柱，流动相为体积比90：10的正己烷：异丙醇溶液，进样量为20μl，柱温为25℃，波长为215nm，流速为1.0ml/min；按照外标法计算(s)-3-羟基四氢呋喃和(r)-3-羟基四氢呋喃的含量，按照面积归一法计算对映异构体过量值(ee值)。

27、作为一种可能的实施方式，进一步，步骤1)中3-羟基四氢呋喃样品的衍生化，具体步骤如下：

28、将三乙胺和二氯甲烷混合，再加入4-硝基苯甲酰氯，搅拌反应，然后加入待测3-羟基四氢呋喃样品，将样品中3-羟基四氢呋喃衍生化。

29、作为一种较优的实施方式，优选的，所述3-羟基四氢呋喃、三乙胺和4-硝基苯甲酰氯的摩尔比为1：2：1.5。

30、发明的有益效果在于：

31、本发明提供了几种羰基还原酶突变体，并利用羰基还原酶突变体不对称还原四氢呋喃-3-酮制备单一立体构型的3-羟基四氢呋喃。与化学法相比，具有反应条件温和、操作简单、生产安全、无副产物、成本低且绿色环保等优势。

32、此外，本发明还提供了一种3-羟基四氢呋喃样品的光学纯度测定方法，目前3-羟基四氢呋喃样品的光学纯度的检测方法中多以气相检测为主，但是目前所报道的气相检测方法条件要求精细、基线波动较大、峰型跨度宽、不对称、响应值低等都不利于3-羟基四氢呋喃样品中异构体的检出和定量。本发明结合3-羟基四氢呋喃的化学性质，将3-羟基四氢呋喃样品进行衍生化处理，并结合液相色谱进行光学纯度的测定，检测方法容易控制、基线平稳、峰型适中对称、峰高合适，利于异构体的检出和光学纯度的准确测定。