一种禽呼肠孤病毒变异毒株及其应用

本发明涉及禽呼肠孤病毒毒株的分离和应用领域，具体涉及一种禽呼肠孤病毒变异毒株及其应用。

背景技术：

1、禽呼肠孤病毒(avian reovirus，arv)是呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属中的一种无囊膜、线性双股rna病毒，其病毒粒子呈球形为20面体对称结构。arv双链rna基因包括10个片段，大小大约为23kb。这些基因组片段分为3组：l、m和s。l组为大组包括l1、l2、l3三个基因片段；m组为中组包括m1、m2、m3三个基因片段：s组为小组包括s1、s2、s3、s4四个基因片段，共有10个基因片段可以编码12种蛋白，包括参与病毒粒子构成的结构蛋白λa、λb、λc、μa、μb、σa、σb、σc和不构成成熟粒子的非结构蛋白μns、p10、p17、σns。自1985年王锡坤首次证实我国存在本病以来，各地相继分离到多株arv，各地也纷纷报道了arv的感染。arv会造成肉鸡生长迟缓、饲料转化率低、羽毛生长不良、关节炎和肠道疾病，是能导致肉鸡传染性发育迟缓综合征的病原体之一。与其他rna病毒一样，arv易变异，进化出致病力和毒力强弱不等的毒株，可使鸡只因感染不同毒株而出现不同程度的临床症状，但关节炎及肠道疾病仍是其典型症状。

2、但是，目前还没有特效的药物可以用于arv的临床治疗。因此，亟需建立快速敏感的检测体系用于arv的早期诊断，准确判定机体的感染状态，对未感染的动物进行有效保护。

3、此外，对于arv感染引起的疾病的防控，除了严格的生物措施外，开发有效的疫苗对于该疾病的综合防控至关重要。但是，由于arv变异毒株被不断发现，会导致经典的呼肠孤病毒株疫苗低效或无效，进而引起鸡群大面积发病，生产效益损失严重，因此对于新发现的毒株进行密切追踪研究，并针对性地开发疫苗具有现实意义。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种禽呼肠孤病毒变异毒株及其应用。本发明从发病的鸡的肌腱和盲肠扁桃体中分离得到一株禽呼肠孤病毒变异毒株，并对该禽呼肠孤病毒变异毒株的细胞嗜性、致病性和免疫原性进行了检测，建立了针对该禽呼肠孤病毒变异毒株的荧光定量pcr检测方法并开发了相关疫苗，为禽呼肠孤病毒的监测和防治提供了保障。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供了一株禽呼肠孤病毒变异毒株，其保藏编号为：cctccno：v202380。

4、本发明的第二方面，提供了所述禽呼肠孤病毒变异毒株在制备禽用疫苗中的应用。

5、进一步的，所述禽用疫苗包括禽呼肠孤病毒灭活疫苗。

6、本发明的第三方面，提供了一种预防或治疗禽呼肠孤病毒病的疫苗组合物，所述疫苗组合物含有免疫有效量的灭活的所述的禽呼肠孤病毒株。

7、进一步的，所述疫苗组合物中还含有药学上可接受的佐剂。

8、进一步的，所述疫苗组合物为灭活疫苗。

9、本发明的第四方面，提供了一种预防或治疗呼肠孤病毒病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

10、(1)将保藏编号为cctcc no：v202380的禽呼肠孤病毒接种到lmh细胞系中，对禽呼肠孤病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，获得禽呼肠孤病毒株病毒液；

11、(2)将禽呼肠孤病毒株病毒液灭活，加入吐温-80混合作为水相，以白油、硬脂酸铝和司本-80混合作为油相，将水相和油相混合均匀，乳化，得到预防或治疗禽呼肠孤病毒病的灭活疫苗；

12、所述步骤(2)中，禽呼肠孤病毒株病毒液灭活的方法为：加入终浓度为0.15％的甲醛，37℃灭活24h；

13、所述步骤(2)中，所述禽呼肠孤病毒株病毒液与吐温-80加入的体积比为96∶4；所述油相中，白油、硬脂酸铝和司本-80加入的体积比为95∶1∶5；所述水相和油相按体积比为1∶2进行混合。

14、本发明的第五方面，提供了一种用于检测所述禽呼肠孤病毒变异毒株的引物组合，所述引物组合包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物为序列如seq idno.1和seq id no.2所示核酸分子。

15、本发明的第六方面，提供了引物组合在构建检测所述禽呼肠孤病毒变异毒株的荧光定量pcr反应体系中的应用。

16、进一步的，所述荧光定量pcr反应体系包括：green premix pro taq hsqpcr mix 10μl，浓度为10μmol/μl的上游引物和下游引物各0.5μl，rnase free ddh2o 8μl，待检测的样品dna模板1μl。

17、本发明的有益效果：

18、本发明涉及的禽呼肠孤病毒2023arv-gs-sdau-1为现有禽呼肠孤病毒的变异株，其能够导致雏鸡肌腱内胶原纤维断裂溶解；法氏囊淋巴细胞丢失；胸腺淋巴细胞丢失；十二指肠肠绒毛断裂，肠腺塌陷；肠道点状出血，除此之外，可以造成关节肿胀。与其他禽呼肠孤病毒相比，其对于肾脏具有明显致病性，可以引起肾间质出血，肾小管上皮细胞脱落。本发明涉及的禽呼肠孤病毒2023arv-gs-sdau-1可以在lmh细胞中可以产生明显的细胞病变，与现有呼肠孤病毒相比，其在lmh细胞中产生病变的速度更快，本发明的禽呼肠孤病毒023arv-gs-sdau-1在lmh细胞中于感染6h内即可出现细胞病变，可以短时间内大量增殖，而多种禽呼肠孤病毒在lmh细胞中感染12h才会出现细胞病变；本发明的禽呼肠孤病毒023arv-gs-sdau-1的tcid50可达109.33/ml，也高于多种禽呼肠孤病毒。本发明首次分离得到的禽呼肠孤病毒变异毒株，经过pcr、rt-pcr检测和回归动物实验，确定了其新型禽呼肠该孤病毒变异毒株，在分子遗传学及其生物学特性上有着显著的差异，本发明的禽呼肠孤病毒023arv-gs-sdau-1可以作为优异的疫苗株，用于疫苗的制备该研究，为我国养鸡场对该病的综合防控提供基础。

技术特征：

1.一株禽呼肠孤病毒变异毒株，其保藏编号为：cctcc no:v202380。

2.权利要求1所述禽呼肠孤病毒变异毒株在制备禽用疫苗中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述禽用疫苗包括禽呼肠孤病毒灭活疫苗。

4.一种预防或治疗禽呼肠孤病毒病的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物含有免疫有效量的灭活的如权利要求1所述的禽呼肠孤病毒株。

5.根据权利要求4所述疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中还含有药学上可接受的佐剂。

6.根据权利要求5所述疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为灭活疫苗。

7.一种预防或治疗呼肠孤病毒病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.一种用于检测权利要求1所述禽呼肠孤病毒变异毒株的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物为序列如seq id no.3和seqid no.4所示核酸分子。

9.权利要求8所述的引物组合在构建检测权利要求1所述禽呼肠孤病毒变异毒株的荧光定量pcr反应体系中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述荧光定量pcr反应体系包括：green premix pro taq hs qpcr mix 10μl，浓度为10μmol/μl的上游引物和下游引物各0.5μl，rnase free ddh2o 8μl，待检测的样品dna模板1μl。

技术总结
本发明公开了一种禽呼肠孤病毒变异毒株及其应用，属于禽呼肠孤病毒毒株的分离和应用领域，本发明通过对鸡关节肿胀样本进行了病原的分离鉴定与纯化，得到了一株禽呼肠孤病毒株，其保藏编号为CCTCC NO:V202380，在10％血清培养基的LMH细胞中传代至8代，其TCID50可达109.33/ml，LMH感染6h内即可出现细胞病变。经过PCR、RT‑PCR检测和回归动物实验，确定了其新型禽呼肠孤病毒变异毒株在分子遗传学及其生物学特性上有着显著的差异，进而建立针对该禽呼肠孤病毒变异毒株的荧光定量PCR检测方法并开发了相关疫苗，该研究为我国养鸡场对该病的综合防控提供了病毒和技术基础。

技术研发人员：成子强,周德方,宋振锐,杨琦
受保护的技术使用者：山东农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15