一种能够高效的获得足够数量的、高纯度人CR神经元的培养基、方法及其应用

本发明涉及细胞，尤其涉及一种能够高效的获得足够数量的、高纯度人cr神经元的培养基、方法及其应用。

背景技术：

1、脑皮层主要包含两种神经元：兴奋性投射神经元和抑制性中间神经元，它们之间相互连接形成神经回路，调控机体的各项生理活动。其中，中间神经元是一类重要的环路调控神经元，主要是通过gaba作为神经递质来调控兴奋性神经元的活动。calretinin(cr)中间神经元是其中一种皮层gaba能神经元，在早期神经系统发育过程中，gaba能神经元起源于端脑腹侧。cr神经元大约占据了10％-30％的gaba能神经元。根据不同的钙连接蛋白的表达，中间神经元主要可以分为三种类型，即parvalbumin(pv)、calbindin d28k(cb)和calretinin(cr)神经元。其中cr神经元主要分布在皮层的ii和iii层，参与调控大脑血流，能量及代谢，承担多种重要的功能。当cr神经元发生损伤病变后，会引起一系列的精神，运动障碍，导致发生各种各样的神经发育和退行性精神疾病，如帕金森疾病，亨廷顿舞蹈症，卒中等。

2、目前，在体外获得cr神经元的主要途径是通过多能干细胞过表达关键转录因子,如nkx2.1等，然而，这些研究都存在较大的缺陷(1)基因过表达会带来基因组的不稳定，细胞系的安全性存在风险；(2)纯度不高。研究中产生的gaba神经元亚型种类繁多，其中cr神经元的比例多数不到20％，部分报道表明需要分化到6个月后比例才能达到77％；(3)cr神经元分化实验的流程更复杂，时间更久；(4)无法获得稳定的前体细胞，进行大量扩增。此外，还有一些研究报道利用腹侧诱导形态分子shh结合其他的小分子或生长因子能够将人es细胞和ips细胞诱导为功能性gaba能中间神经元，这些神经元进一步鉴定为sst和pv神经元，缺乏cr的表达。因此，如何高效的能够产生足够数量、高纯度的cr中间神经元仍然是一个挑战。

技术实现思路

1、本发明提供一种能够高效的获得足够数量的、高纯度人cr神经元的培养基、方法及其应用。

2、本发明提供一种细胞培养基，包括：神经元基础培养基、0.2 -20μm的iwp2、2-100ng/ml的shh和0.2 -20μm的purmorphamine。

3、根据所述的细胞培养基，包括：0.5-5μm的iwp、5-100ng/ml的shh和0.2-5μm的purmorphamine；

4、优选的，包括0.5-3μm的iwp2、5-30ng/ml的shh和0.2-2μm的purmorphamine。

5、优选的，所述细胞培养基包括：0.8-1.2μm的iwp、12-18ng/ml的shh和1.2-1.8μm的purmorphamine。

6、根据所述的培养基，所述神经元基础培养基为neurobasal培养基，和/或，神经元基础培养基。

7、根据所述的细胞培养基，还包括b27、n2和neaa中的一种、两种或三种。

8、优选的，所述培养基中包括2.5-10μl/ml(优选为3-10μl/ml)的n2；

9、优选的，所述培养基中包括5-20μl/ml(优选为6-20μl/ml)的b27；

10、优选的，所述培养基中包括3-10μl/ml(优选为10μl/ml)的neaa。

11、本发明还提供一种培养基组合，包括所述的细胞培养基和建立神经上皮干细胞((neurepithelium cells))的培养基。

12、优选的，所述建立神经上皮干细胞的培养基包括：分化培养基；所述分化培养基包括：neurobasal培养基、b-27添加剂、n-2添加剂、bfgf、wnt信号通路的激动剂、gsk3的抑制剂、tgf-β信号通路的抑制剂、notch信号通路抑制剂、alk2以及alk3信号通路的抑制剂，其中，所述notch信号通路抑制剂为compound e。利用神经上皮干细胞诱导分化cr神经元，前期专利《一种建立神经干细胞的培养基、方法及其应用》，能够获得长期进行稳定传代的神经上皮干细胞，可以进行规模化的生产cr神经元，以满足临床应用的需求。

13、进一步优选的，所述诱导分化神经上皮干细胞的培养基还包括：扩增培养基，所述扩增培养基包括：neurobasal培养基、b-27添加剂、n-2添加剂、bfgf、wnt信号通路的激动剂、gsk3抑制剂、tgf-β信号通路的抑制剂和白血病抑制因子。

14、根据所述的培养基组合，在所述分化培养基中，所述bfgf的浓度为3-100ng/ml；所述compound e的浓度为0.05-10μm；

15、和/或，在所述扩增培养基中，所述bfgf的浓度为3-100ng/ml；所述白血病抑制因子的浓度为50-5000u/l。

16、在所述分化培养基中，所述wnt信号通路的激动剂和gsk3抑制剂均为chir99021；所述tgf-β信号通路的抑制剂为sb431542；所述notch信号通路抑制剂为compound e；所述alk2以及alk3信号通路的抑制剂为ldn193189；和/或在所述扩增培养基中，所述wnt信号通路的激动剂和所述gsk3抑制剂均为chir99021；所述tgf-β信号通路的抑制剂为sb431542。

17、优选的，在所述分化培养基中，所述chir99021的浓度为0.3-30μm，所述sb431542的浓度为2-50μm；所述ldn193189的浓度为0.1-10μm。

18、和/或，在所述扩增培养基中，所述chir99021的浓度为0.3-30μm；所述sb431542的浓度为5-50μm。

19、本发明还提供一种利用所述的培养基获得神经上皮干细胞的方法，所述神经上皮干细胞能自我组装为神经管结构，所述方法，包括以下步骤：将多能干细胞经过胶原酶消化成细胞团块；将所述细胞团块悬浮在所述分化培养基中并进行悬浮培养，使其分化为初级神经上皮干细胞；将所述初级神经上皮干细胞使用所述扩增培养基进行培养，获得能够稳定传代的神经上皮干细胞。

20、根据所述的方法，在所述步骤将所述初级神经上皮干细胞使用所述扩增培养基进行培养，获得能够稳定传代的神经上皮干细胞之后，还包括：将所述神经上皮干细胞进行稀释，得到单个神经上皮干细胞；将所述单个神经上皮干细胞利用所述扩增培养基培养14-15天，得到该单个神经上皮干细胞自我组装成的神经管。

21、根据所述的方法，在所述步骤将所述初级神经上皮干细胞使用所述扩增培养基进行培养，获得能够稳定传代的神经上皮干细胞之后，还包括：将所述神经上皮干细胞在含有neurobasal培养基、b27、非必需氨基酸以及谷氨酰胺的神经元分化培养基上培养并使其分化，得到纯度为40％-100％的神经元。

22、根据所述的方法，在所述将多能干细胞经过胶原酶消化成细胞团块的步骤中：所述消化时间为5-40分钟。

23、根据所述的方法，在所述将所述初级神经上皮干细胞使用所述扩增培养基进行培养，获得能够稳定传代的神经上皮干细胞的步骤之后，还包括：将所述神经上皮干细胞利用0.05％的胰酶进行消化传代，获得稳定的神经上皮干细胞系。

24、根据所述培养基组合，所述neurobasal培养基包括：neurobasal基础培养基和/或神经元基础培养基。

25、本发明还提供一种制备cr神经元的方法，包括利用所述培养基或所述培养基组合。

26、根据所述制备cr神经元的方法，利用所述培养基将神经上皮干细胞分化产生cr神经元；

27、优选的，利用所述分化培养基将多能干细胞诱导分化为初级神经上皮干细胞。

28、进一步优选的，利用所述扩增培养基扩增所述初级神经上皮干细胞产生神经上皮干细胞；

29、优选的，利用所述培养基将神经上皮干细胞分化培养7-14天；

30、进一步优选的，培养10-12天。

31、本发明还提供所述培养基、所述培养基组合或所述制备cr神经元的方法在制备cr神经元中的应用。

32、本发明的有益效果：

33、1)利用本发明所述培养基将神经上皮干细胞分化产生cr神经元，能够高效的获得足够数量的、高纯度人cr神经元。

34、2)利用本发明所述培养基组合可以更高效的高质量生产cr神经元。整个cr神经元的生产过程包含两个阶段：多能干细胞诱导分化神经上皮干细胞，在这个阶段获得稳定、均质的神经上皮干细胞，可以进行规模化扩增，以满足临床治疗细胞数目的要求；神经上皮干细胞分化产生cr神经元。利用本发明所述的培养基组合，可以获得稳定的前体细胞，进行大量扩增。

35、3)利用本发明的方法制备cr神经元，不存在安全性风险，流程简单，时间更短。采用腹侧诱导信号蛋白shh结合化学小分子purmorphamine和wnt信号通路的抑制剂iwp2来促进神经上皮干细胞定向分化为cr神经元，规避了对细胞进行遗传操作带来的基因组不稳定，导致的细胞系安全性的问题；cr神经元分化培养基成分清楚和简单(主成分是三个因子)，因此实验结果在不同批次之间或细胞系之间更稳定；实验周期更短，在分化2周内就能够检测到高比例的cr能神经元。

36、4)将本发明所述培养基用于神经干细胞诱导分化产生cr神经元，可以高效的获得大量高质量cr神经元，适用于工业生产。