二氢青蒿酸脱氢酶及其应用

本发明涉及生物合成领域，具体涉及一种二氢青蒿酸脱氢酶及其应用。

背景技术：

1、青蒿素(artemisinin,art)是从药用植物黄花蒿(artemisia annua l.)中分离获得的一种含有独特过氧桥结构的倍半萜类化合物，2001年，世界卫生组织(world healthorganization,who)确定以art为基础的联合疗法是治疗急性疟疾的最佳选择。由于其较好的抗疟活性及其在黄花蒿中极低的含量(0.1-1％，干重)，使得art的生产途径备受关注。

2、1983年，g.schmid和w.hofheinz两位科学家首次实现了art的全合成，随着时间推进，art的全合成路线不断被改进优化。但化学合成art过程复杂、产量低且环境污染严重，未能被进行大规模工业化生产。随着合成生物学技术的不断发展，越来越多的科学家开始尝试在酵母和烟草等微生物体系中构建高产art的底盘菌株。2006年，dae-kyun ro等人在酿酒酵母中构建了产青蒿酸(artemisinic acid,aa)(100mg/l)的底盘菌株，开启了采用半合成法生产art的新篇章，2014年，c.j.paddon等人在酿酒酵母中构建了高产aa(25g/l)的底盘菌株，并通过半合成法实现了art的生产。至今为止，art的终端生物合成途径未被完全解析阐明，在黄花蒿中过氧桥是如何产生的仍然是art生物合成途径解析的瓶颈问题，使得异源合成art受到巨大限制。因此，目前art的来源主要依赖于从黄花蒿植株中直接提取获得。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种二氢青蒿酸脱氢酶，具有催化青蒿酸和二氢青蒿酸相互转化的功能，为高产二氢青蒿酸底盘菌株的构建提供了新的思路和方法，对于青蒿素类化合物的规模化生产具有重要作用，为青蒿素终端生物合成途径的解析提供理论依据。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、本发明首次从黄花蒿中提取分离得到一种催化青蒿酸和二氢青蒿酸相互转化的氧化还原酶，命名为二氢青蒿酸脱氢酶(dihydroartemisinic acid dehydrogenase，aa-dhaadh)，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明提供了编码所述二氢青蒿酸脱氢酶的基因，其碱基序列如seq id no.2所示。

5、本发明还提供了所述二氢青蒿酸脱氢酶在催化青蒿酸和二氢青蒿酸相互转化中的应用。

6、本发明对二氢青蒿酸脱氢酶进行酶学性质考察，所述二氢青蒿酸脱氢酶催化青蒿酸和二氢青蒿酸的ph值为4.5-10.5，优选为6-9，催化温度为25-40℃，催化时间为1-8h。

7、本发明分别对二氢青蒿酸脱氢酶催化青蒿酸和二氢青蒿酸的动力学参数进行了测定，结果显示，二氢青蒿酸脱氢酶催化青蒿酸的km值为340.00μm，催化二氢青蒿酸的km值为532.35μm，二氢青蒿酸脱氢酶对青蒿酸的亲和力强于二氢青蒿酸。

8、本发明还提供了二氢青蒿酸脱氢酶在高产青蒿素类化合物底盘菌株的构建中的应用。

9、本发明提供了上述二氢青蒿酸脱氢酶的制备方法，包括如下步骤：

10、(1)以黄花蒿为原料，提取得到黄花蒿粗酶；

11、(2)以催化活性为导向对黄花蒿粗酶依次采用硫酸铵沉淀、葡聚糖g50凝胶柱层析、葡聚糖g25凝胶柱层析和deae-sepharose fast flow阴离子交换柱层析进行分离纯化，得到活性组分deae-2；

12、(3)对deae-2活性组分进行质谱鉴定，经候选酶筛选和功能验证得到二氢青蒿酸脱氢酶。

13、优选地，步骤(2)中，所述硫酸铵的饱和度为60-90％。

14、优选地，步骤(3)中，所述葡聚糖g50凝胶柱层析和葡聚糖g25凝胶柱层析中的采用的流动相为pbs溶液，流速为0.20-0.80ml/min。

15、优选地，步骤(2)中，所述deae-sepharose fast flow阴离子交换柱层析中依次采用0.03m tris+0.30m nacl、0.03m tris+1.00m nacl、0.03m tris+2.00m nacl共3个梯度进行洗脱。

16、本发明与现有技术相比，具有如下优异效果：

17、本发明以黄花蒿为原料，提取黄花蒿粗酶，以催化活性为导向对黄花蒿粗酶依次采用as沉淀、葡聚糖g50凝胶柱层析、葡聚糖g25凝胶柱层析和deae-sepharose fast flow阴离子交换柱层析分离纯化，首次从黄花蒿中提取分离得到一种能催化青蒿酸和二氢青蒿酸相互转化的氧化还原酶，命名为二氢青蒿酸脱氢酶(dihydroartemisinic aciddehydrogenase，aa-dhaadh)。对aa-dhaadh进行酶学性质考察，发现aa-dhaadh对青蒿酸的亲和力强于二氢青蒿酸，为高产二氢青蒿酸底盘菌株的构建提供了新的思路和方法，对于青蒿素类化合物的规模化生产具有重要作用；丰富了青蒿素生物合成途径的线路，为青蒿素终端生物合成途径的解析提供理论依据。

技术特征：

1.二氢青蒿酸脱氢酶，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.编码权利要求1所述的二氢青蒿酸脱氢酶的基因，其碱基序列如seq id no.2所示。

3.权利要求1所述的二氢青蒿酸脱氢酶在催化青蒿酸和二氢青蒿酸相互转化中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述二氢青蒿酸脱氢酶催化青蒿酸和二氢青蒿酸的ph值为4.5-10.5，优选为6-9，催化温度为25-40℃，催化时间为1-8 h。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述二氢青蒿酸脱氢酶催化青蒿酸的km值为340.00 μm，催化二氢青蒿酸的km值为532.35 μm。

6.权利要求1所述的二氢青蒿酸脱氢酶在高产青蒿素类化合物底盘菌株构建中的应用。

7.权利要求1所述的二氢青蒿酸脱氢酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的二氢青蒿酸脱氢酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述硫酸铵的饱和度为60-90%。

9.根据权利要求7所述的二氢青蒿酸脱氢酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述葡聚糖g50凝胶柱层析和葡聚糖g25凝胶柱层析中的采用的流动相为pbs溶液，流速为0.20-0.80 ml/min。

10.根据权利要求7所述的二氢青蒿酸脱氢酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述deae- sepharose fast flow阴离子交换柱层析中依次采用0.03 m tris+0.30 m nacl、0.03 m tris+1.00 m nacl、0.03 m tris+2.00 m nacl共3个梯度进行洗脱。

技术总结
本发明公开了一种二氢青蒿酸脱氢酶及其应用。本发明以黄花蒿为原料，在催化活性指导下，首次提取分离得到一种可以催化青蒿酸和二氢青蒿酸相互转化的氧化还原酶，命名为二氢青蒿酸脱氢酶（Dihydroartemisinic acid dehydrogenase，Aa‑DHAADH）。其编码序列特征如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明对Aa‑DHAADH进行酶学性质考察，发现Aa‑DHAADH对青蒿酸的亲和力强于二氢青蒿酸，为高产二氢青蒿酸底盘菌株的构建提供了新的思路和方法，对于青蒿素类化合物的规模化生产具有重要作用；丰富了青蒿素生物合成途径的线路，为青蒿素终端生物合成途径的解析提供理论依据。

技术研发人员：朱建华,郭子正,于荣敏
受保护的技术使用者：暨南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15