锚定ERRγ-LBD的乳酸乳球菌颗粒及其制备与应用

本发明属于生物工程领域，具体涉及锚定errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒及其制备与应用。

背景技术：

1、双酚a(bpa)是一种具有抗雄激素作用和类雌激素样作用的环境内分泌干扰物，其广泛用于食品包装材料、水管和锡罐中，而bpa会在高温、酸性和碱性条件下污染水和食物。因此，人们在日常生活中不可避免地会经肠道吸收bpa，在人体组织和液体包括血液、母乳和尿液中都曾检测到不同剂量的bpa。bpa作为内分泌干扰物会导致一系列疾病，如支气管炎、肺炎、肝病、肾病以及各种皮肤和粘膜疾病。同时，研究证实bpa会刺激肝脏、大脑、肾脏的氧化应激，增强炎症因子和凋亡基因的表达。因此，预防bpa引发的机体损伤对人类健康具有重大意义。

2、饮食是bpa进入人体的主要途径之一。研究表明，通过饮食进入人体的bpa可以通过肠肝轴、肠睾轴等肠器官轴对肝脏、生殖系统等造成影响，因此肠道是影响bpa危害人体健康的关键部位。清除肠道中尚未被人体吸收的bpa，有利于阻止bpa通过肠器官轴侵入体内，更可直接降低人体中bpa的含量，从而更有效地避免bpa引起疾病。

3、生物吸附法是物质通过共价、静电或分子力的作用吸附在生物体表面的方法。近几年，该方法已应用于体内重金属的吸附清除。但是，有关利用吸附法对肠道内bpa吸附清除的相关报道尚未发现。雌激素相关受体γ(errγ)是雌激素相关受体(err)亚家族的一个成员。研究表明，bpa及其类似物可以与errγ配体结合结构域(errγ-lbd)进行特异性结合，且bpa与errγ有强结合力，ic50值达到了9.78±0.87。但采用直接利用errγ-lbd蛋白吸附bpa的方法，存在蛋白纯化步骤复杂、生产成本高、容易降解以及稳定性差的问题，而且当该蛋白用于人体时，还会面临消化系统中胃酸腐蚀以及蛋白酶降解的问题。

4、乳酸乳球菌(lab)是全球公认的安全益生菌，在自然界和人体肠道中广泛存在。与其他细菌相比，lab可以在胃酸等一些极端的环境下存活并且保持活性。因此，使用lab递送外源蛋白在生物技术应用如疫苗研制、药物递送、基因治疗等领域都很有前景。

5、鉴于此，开发利用乳酸乳球菌锚定errγ-lbd蛋白，以期吸附肠道中的双酚a后经消化系统排出体外，从而减少由双酚a暴露引起的损伤，具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的正是针对上述技术现状，提供一种锚定errγ-lbd蛋白的可清除肠道bpa的食品级乳酸乳球菌颗粒制备方法。

2、为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：

3、本发明提供了一种锚定errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒的制备方法，包括如下步骤：

4、(1)将errγ-lbd基因与acma基因通过linker拼接起来，得到重组基因errγ-lbd-acma；

5、(2)将重组基因errγ-lbd-acma与表达载体pet-20b连接，得到重组载体pet20b-errγ-lbd-acma；

6、(3)将重组载体pet20b-errγ-lbd-acma转化至大肠杆菌感受态细胞，得到工程菌；

7、(4)将工程菌以异丙基硫代半乳糖苷iptg诱导表达并培养，得到重组蛋白errγ-lbd-acma；

8、(5)将重组蛋白errγ-lbd-acma锚定至乳酸乳球菌颗粒表面。

9、进一步地，在所述步骤(1)中，errγ的核苷酸序列如seq id no：1所示，acma的核苷酸序列如seq id no：2所示，linker的核苷酸序列如seq id no：3所示。

10、进一步地，在所述步骤(4)中，工程菌以异丙基硫代半乳糖苷iptg诱导表达并培养的具体步骤为：将工程菌接种于含氨苄青霉素amp的液体lb培养基中进行扩大培养，当od600达0.4-0.6时，加入终浓度为0.5-1.0mm的iptg进行诱导培养，收集菌液，离心得到菌体，裂解菌体，离心收集上清液，上清液中即存在重组蛋白errγ-lbd-acma。

11、进一步地，在所述步骤(5)中，乳酸乳球菌颗粒来自乳酸乳球菌nz9000。

12、进一步地，在所述步骤(5)中，乳酸乳球菌颗粒的制备方法为：将乳酸乳球菌在gm17液体培养基中培养，直到od600达3-4，离心收集菌体，然后在含有10％三氯乙酸的溶液中煮沸30min，经pbs洗涤后得到乳酸乳球菌颗粒。

13、进一步地，在所述步骤(5)中，重组蛋白errγ-lbd-acma锚定至乳酸乳球菌颗粒表面的步骤为：将步骤(4)收集得到的上清液与乳酸乳球菌颗粒重悬，静置，离心收集菌体，再用pbs溶液洗涤，重悬。

14、本发明还提供了前述的方法制备得到的锚定errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒，其是由重组蛋白errγ-lbd-acma通过非共价键锚定至乳酸乳球菌颗粒表面而形成。

15、本发明还提供了前述的锚定errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒作为双酚a吸附剂的应用。

16、进一步地，所述锚定errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒作为人体内双酚a吸附剂。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

18、1.本发明制备的表面锚定errγ-lbd蛋白的乳酸乳球菌颗粒可以通过口服进入人体，在肠道中吸附bpa并经消化系统排出，降低肠道中的bpa含量，有效避免bpa引发疾病。

19、2.对重组菌体进行超声破碎后离心，上清液直接与乳酸乳球菌颗粒进行锚定，省去了重组蛋白分离纯化的繁琐步骤，降低了蛋白的损耗，高效且成本低廉。

20、3.锚定了errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒是使用食品级乳酸乳球菌制得，不携带抗性基因，进入环境后不会引起环境污染，安全无毒。

技术特征：

1.一种锚定errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的锚定errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，errγ的核苷酸序列如seq id no：1所示，acma的核苷酸序列如seq idno：2所示，linker的核苷酸序列如seq id no：3所示。

3.根据权利要求1所述的锚定errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，工程菌以异丙基硫代半乳糖苷iptg诱导表达并培养的具体步骤为：将工程菌接种于含氨苄青霉素amp的液体lb培养基中进行扩大培养，当od600达0.4-0.6时，加入iptg进行诱导培养，收集菌液，离心得到菌体，裂解菌体，离心收集上清液，上清液中即存在重组蛋白errγ-lbd-acma。

4.根据权利要求3所述的锚定errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒的制备方法，其特征在于，所述异丙基硫代半乳糖苷iptg的终浓度为0.5-1.0mm。

5.根据权利要求1所述的锚定errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，乳酸乳球菌颗粒来自乳酸乳球菌nz9000。

6.根据权利要求1所述的锚定errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，乳酸乳球菌颗粒的制备方法为：将乳酸乳球菌在gm17液体培养基中培养，直到od600达3-4，离心收集菌体，然后在含有三氯乙酸的溶液中煮沸一段时间后，经pbs洗涤后得到乳酸乳球菌颗粒。

7.根据权利要求3所述的锚定errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，重组蛋白errγ-lbd-acma锚定至乳酸乳球菌颗粒表面的步骤为：将步骤(4)收集得到的上清液与乳酸乳球菌颗粒重悬，静置，离心收集菌体，再用pbs溶液洗涤，重悬。

8.权利要求1～7任意一项所述方法制备得到的锚定errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒，其特征在于，所述锚定errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒是由重组蛋白errγ-lbd-acma通过非共价键锚定至乳酸乳球菌颗粒表面而形成。

9.权利要求8所述的锚定errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒作为双酚a吸附剂的应用。

10.根据权利要求9所述的锚定errγ-lbd的乳酸乳球菌颗粒的应用，其特征在于，作为人体内双酚a吸附剂。

技术总结
本发明涉及生物工程领域，具体涉及锚定ERRγ‑LBD的乳酸乳球菌颗粒及其制备与应用。本发明将ERRγ‑LBD基因通过linker与acmA基因拼接，得到重组的ERRγ‑LBD‑acmA基因，转化至大肠杆菌感受态细胞，然后利用IPTG诱导表达，得到重组蛋白ERRγ‑LBD‑acmA，再与乳酸乳球菌颗粒共孵育，即可将重组蛋白通过非共价键锚定至乳酸乳球菌颗粒表面。本发明制备的表面锚定ERRγ‑LBD蛋白的乳酸乳球菌颗粒，能吸附BPA，制备方法具有简单高效、安全无毒、无需蛋白纯化、成本低的优点。

技术研发人员：郭建全,牛亚丽,杨李阳,刘良坡
受保护的技术使用者：山西医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15