牛结节性皮肤病毒P122重组蛋白、其编码基因、重组载体、重组细胞株、疫苗及应用的制作方法

本发明涉及动物疫苗与兽用生物制品，特别涉及一种牛结节性皮肤病毒p122重组蛋白、其编码基因、重组载体、重组细胞株、疫苗及应用。

背景技术：

1、牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，lsd)是由牛结节性皮肤病毒(lumpy skindisease virus，lsdv)感染牛引起的一种烈性传染病，临床表现为高热(＞40.5℃)、内脏及皮肤水肿、肩胛下或股前淋巴结肿大、局部皮肤形成特征性结节(约10～50mm)或溃疡，消化道和呼吸道以及内脏器官表面发生痘状结节等为主要特征。lsd可导致泌乳牛产奶量减少、公牛暂时或永久不育、皮张利用价值大幅降低等。该病全球发病率在2％～45％之间，致死率通常低于10％，其中奶牛最易感。节肢动物(主要是吸血昆虫)机械性间接传播是lsdv主要的传播途径。该病在跨境动物疫病中尤为重要，世界动物卫生组织(oie)将其列为必须通报类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。

2、lsdv属痘病毒科(poxviridae)，与绵羊痘病毒(sppv)和山羊痘病毒(gtpv)同属羊痘病毒属。lsdv是双链dna病毒，全基因组共由156个假定基因组成，与其它痘病毒一样，病毒基因由中间核心区域以及两端反向的重复序列组成，且羊痘病毒属各成员之间的基因组序列高度同源。血清学上很难将属内各病毒成员加以区分，lsdv、sppv和gtpv在血清学上均存在交叉反应，但lsdv只有一种血清型，可以通过感染动物的种属特性进行初步判定，同时还需结合多种诊断方法加以最终诊断，也可对病毒分离株开展基因组测序加以鉴定。羊睾丸细胞(lt)、绵羊胚胎睾丸细胞(oa3.ts)、牛肾细胞(mdbk)、乳仓鼠肾细胞(bhk-21)以及非洲绿猴肾细胞(vero)等对lsdv均易感，因此常用于分离该病毒。

3、通常情况下，lsd在流行区域间隔几年才会暴发流行一次，目前尚不清楚病毒是否存在特定的储藏宿主，也不清楚病毒在两次流行间隔期是如何存活的。新生(或未免疫)动物数量持续增多、媒介生物活跃系数上升，以及易感动物不受控制的转移等均有可能导致lsd疫情大规模暴发。原发病例通常与畜群或周边畜群是否引入带病动物有关，畜群易感性取决于免疫状态、年龄和品系。一般来说，同非洲和亚洲本土动物相比，产奶量较高的欧洲品种牛更易感，产奶量高的奶牛品种更易感。

4、lsd首次于1929年在赞比亚病牛中被报道，然后迅速传播至撒哈拉以南的大多数非洲国家。目前，在除阿尔及利亚、摩洛哥、突尼斯和利比亚外的非洲地区广泛流行。自2013年以来，lsd已传播至中东地区(以色列、巴勒斯坦、约旦、黎巴嫩、科威特、沙特阿拉伯、伊拉克、伊朗、阿曼、也门、阿拉伯联合酋长国和巴林等地)，目前仍呈地方性流行；随后在阿塞拜疆、亚美尼亚和哈萨克斯坦、俄罗斯联邦南部(达吉斯坦共和国、车臣共和国、克拉斯诺达尔边疆区、卡尔梅克共和国)和格鲁吉亚等地均暴发了lsd疫情。自2014年以来，lsd传入塞浦路斯北部、希腊、保加利亚、马其顿共和国、塞尔维亚、黑山、阿尔巴尼亚和科索沃、乌干达、埃及、印度。目前，lsd仍呈较大规模的传播和流行。

5、国际兽疫局于2019年8月3日宣布了中国首次确认一起lsd疫情。疫情发生于新疆伊犁哈萨克自治州西北部察布查尔锡伯族自治县，距哈萨克斯坦边境约20km，距俄罗斯边境约780km，共有65头牛被确诊为lsdv阳性，但无死亡病例。基于全基因组系统发育分析表明，中国lsdv株(lsdv/中国/新疆/2019)与2017年俄罗斯lsdv株(lsdv/俄罗斯/萨拉托夫/2017)具有密切的遗传关系，但lsdv/中国/新疆/2019株在lsdv/俄罗斯/萨拉托夫/2017-like集团之外，单独组成了一个新的发育分支，似乎是一个单独的lsdv株系，具有lsdv/俄罗斯/萨拉托夫/2017株未发现的新进化特征。

6、对于lsd，最好的预防、控制手段是提前对受威胁区域的全部牛群进行预防性免疫接种，但全球目前仅有三家疫苗生产商获批生产lsdv弱毒活疫苗，用于免疫预防lsd，且仅限于非洲地区使用，在其他感染地区还需获得当地特定的官方授权才能使用。我国目前针对lsdv疫苗尚属空白，且减毒活疫苗免疫接种动物后会导致受免动物发生诸多不良反应，如暂时性发热和产奶量下降，严重者还可引发全身性不良反应。此外，活疫苗还具有人为散毒的风险。因此，在lsdv和羊痘流行的区域，使用山/绵羊痘弱毒活疫苗免疫接种牛用以预防牛lsdv，但牛接种羊痘病毒活疫苗后的免疫副反应较大，且仅能提供部分的免疫保护。

技术实现思路

1、为解决以上现有技术中存在的问题，本发明提供了一种牛结节性皮肤病毒p122重组蛋白、其编码基因、重组载体、重组细胞株、疫苗及应用。

2、为实现上述目的，本发明提出了如下方案：

3、本发明提供了一种牛结节性皮肤病毒p122重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。

4、本发明还提供了一种牛结节性皮肤病毒p122重组蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。

5、本发明还提供了一种包含所述编码基因的重组载体，所述重组载体以真核表达载体为基础载体。

6、本发明还提供了一种包含所述重组载体的重组细胞株，所述重组细胞株以真核细胞为基础细胞。

7、本发明还提供了一种所述重组细胞株的制备方法，包括以下步骤：

8、1)将牛结节性皮肤病毒p122重组蛋白的编码基因克隆至真核表达载体上，得到重组载体；

9、2)将步骤1)所述重组载体转染至宿主细胞中，依次经培养、筛选后获得高表达牛结节性皮肤病毒p122重组蛋白的重组细胞株。

10、本发明还提供了一种防治牛结节性皮肤病的亚单位疫苗，包括牛结节性皮肤病毒p122重组蛋白，所述牛结节性皮肤病毒p122重组蛋白为以上所述的重组蛋白或利用上述重组细胞株生产得到的重组蛋白。

11、优选的，所述佐剂为sp 01佐剂、montanidetm isa 201vg佐剂和montanidetm isa206vg佐剂中的至少一种。

12、优选的，所述佐剂与牛结节性皮肤病毒p122基因工程重组蛋白的体积比为1:1。

13、本发明还提供了一种所述牛结节性皮肤病毒p122重组蛋白、所述重组蛋白的编码基因、重组载体或重组细胞株在制备用于防治牛结节性皮肤病毒感染的药物中的应用。

14、本发明还提供了一种所述牛结节性皮肤病毒p122重组蛋白、所述重组蛋白的编码基因、重组载体或重组细胞株在制备用于诊断牛结节性皮肤病毒感染的试剂中的应用。

15、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

16、本发明提供的牛结节性皮肤病毒p122重组蛋白在机体内的半衰期长，持续应答的免疫效果好，更少的免疫次数和免疫剂量即能获得良好的免疫保护效果，更有利于动物疫病的免疫防控。

17、本发明提供的防治牛结节性皮肤病的亚单位疫苗是基于所述牛结节性皮肤病毒p122重组蛋白制备而成，通过构建重组cho工程细胞株，经培养、纯化、乳化工艺等制备牛结节性皮肤病基因工程亚单位疫苗，该疫苗能够诱导动物机体产生显著的细胞免疫和体液免疫，免疫原性良好，因此，可以用于制备牛结节性皮肤病毒亚单位疫苗的备选抗原，为牛结节性皮肤病毒基因工程亚单位疫苗的研制奠定了良好的基础。

18、本发明利用p122蛋白具有开发牛结节性皮肤病毒亚单位疫苗的潜能，利用哺乳动物细胞表达系统(cho细胞)表达了lsdv p122重组蛋白，并开展了替代动物(blab/c小鼠)的免疫效力试验，结果显示lsdv p122重组蛋白具有良好的免疫原性，为开发牛结节性皮肤病毒基因工程亚单位疫苗奠定了良好的基础。