TIMP1基因剪接异常TIMP1-S及其应用

本发明涉及生物、医学领域，具体地，本发明涉及一种timp1基因剪接异常的mrna：timp1-s或timp1-l，以及它们的应用。

背景技术：

1、结直肠癌是严重影响人类健康的恶性肿瘤之一。中国是结直肠癌的m高发地区，每年新增结直肠癌病例数约占全球发病总数的30%。最新统计结果显示，2020年我国结直肠癌新增病例超过55.6万，致死约32万例，严重危害国民健康。目前，我国结直肠癌早期诊断率不到20%，大多数患者诊断时已经处于进展期，有的甚至发生了远端转移, 其5年生存率仅为14%。尽管经历了长期的研究，但是结直肠癌的发生发展机制仍未完全明确，以至于结直肠癌患者的临床治疗仍然面临巨大挑战。因此，发现和鉴定结直肠癌癌发生和进展的分子，研究其与结直肠癌发生、临床转归和预后等之间的关系，不仅有助于阐明结直肠癌形成的病理机制，而且对于结直肠癌新的防、诊、治措施的研发有着极为重要的意义。

2、可变剪接（alternative splicing, as）是指pre-mrna在剪接因子与剪接体的共同作用下，去除内含子，生成成熟mrna的过程。据报道，90%以上的基因pre-mrna存在着可变剪接，大大扩大了蛋白质多样性。生物体能够通过rna的可变剪接对不同剪接转录本的表达进行实时调控，从而进一步对内环境以及外环境作出时间空间上的特异性应答。在肿瘤发生发展过程中往往存在着异常的可变剪接，从而导致促癌异构体的表达增加，同时减少抑癌异构体的表达。可变剪接可以通过多种生物学途径，包括血管生成，侵袭及迁移，免疫逃逸以及能量代谢等调控肿瘤的生物学行为。

3、新型基因编辑工具cas13蛋白（vi 型）在其指导rna（guide rna）的辅助下，靶向结合特异序列单链rna，可特异性地编辑或降解细胞内的rna。与dna编辑技术相比，rna编辑不改变编码基因本身（dna碱基改变后不能逆转），在时间上、空间上和效率上更加可控。同时，rna编辑可以同时修改多个基因、同时靶向多拷贝基因的所有转录产物，所以更加高效。在对疾病的基因治疗领域，利用rna编辑技术靶向基因pre-mrna，调节或改变该其剪接模式，诱导产生新的功能性蛋白质异构体，具有重要的应用价值。

4、timp1 作为一种内源性金属蛋白酶抑制因子，在肿瘤微环境的重塑，上皮间质转化，细胞运动及衰老等方面发挥重要的作用。timp1在乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌等多种肿瘤中表达量异常升高，而其详细的机制尚不明确。同时，相关报道显示血液中timp1的水平可作为包括结直肠癌、乳腺癌及胶质母细胞瘤等多种肿瘤的诊断及预后标志物。

技术实现思路

1、本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种timp1基因剪接异常的mrna，以及它们在医药或生物方面的用途。

2、本发明的目的可以通过以下措施达到：

3、一种mrna，它为timp1-s或timp1-l，其中所述timp1-s具有如seq id no. 5所示的碱基序列， 所述timp1- l具有如seq id no. 6所示的核苷酸碱基序列。

4、本发明提供了一种timp1-s或timp1-l在制备治疗或预防癌症的药物方面的用途。

5、本发明中所指的癌症优选为结直肠癌。

6、本发明提供了一种含有timp1-s或timp1-l基因序列的重组表达载体。相关重组表达载体优选为质粒、慢病毒或干细胞。

7、本发明提供的含有timp1-s或timp1-l基因序列的重组表达载体可用于过表达timp1-s或者抑制表达timp1-l。

8、本发明提供了一种特异性促进timp1基因可变剪接的sgrna，它用以提高timp1-s的表达水平或者降低timp1-l的表达水平，其核苷酸碱基序列包括seq id no.1-4所示的核苷酸碱基序列的任意一种或几种。

9、本发明提供了一种用于检测timp1-s或timp1-l表达量的试剂，它用以检测timp1-s或timp1-l的表达量，或者用以将timp1-l和timp1-s的表达量比值作为生物标志物。

10、本发明提供了一种本发明提供了一种用于检测timp1-s或timp1-l表达量的试剂盒，它用以检测timp1-s或timp1-l的表达量，或者用以将timp1-l和timp1-s的表达量比值作为生物标志物。

11、本发明提供了一种用于过表达timp1-s或者抑制表达timp1-l的药物或试剂，该药物或试剂具有治疗或预防癌症的潜在应用价值。

12、本发明提供了一种用于促进timp1基因的剪接的试剂，该试剂具有制备药物的用途，特别是用于治疗或预防结直肠癌的药物。

13、本发明可以包括一种药物，它用于下列的至少之一：促进癌细胞的抑癌亚型timp1-s基因表达升高，抑制结直肠癌细胞的生长，抑制癌细胞的迁移和侵袭。

14、我们进行了全转录组水平的可变剪接分析，通过多种算法和分析软件系统的分析结直肠癌组织中差异表达的剪接事件，进一步在独立结直肠癌样本队列中利用荧光定量pcr，发现了在结直肠癌样本中特异性剪接的基因timp1。

15、我们发现，timp1基因有两个亚型，分别为timp1-l和timp1-s。其中timp1-l是正常剪接的亚型，含有6个外显子；timp1-s是发生异常剪接的亚型，含有4个外显子。我们将外显子不发生跳跃的亚型定义为timp1 -l，发生外显子跳跃的亚型定义为timp1-s。发明人在研究中发现，timp1-s具有抑制癌细胞生长的作用，而timp1-l具有促进癌细胞生长的作用。timp1基因的可变剪接可将timp1-l变为timp1-s。因此，通过促进timp1基因的剪接，可以促进timp1-l型向timp1-s型转变，从而抑制癌细胞生长，起到治疗或预防癌症的目的。

16、本发明中的促进timp1的可变剪接是通过crispr-dcas13实现的。

17、本发明还提供了特异性促进timp1基因可变剪接的sgrna，其中sgrna的序列包括seq id no.1-4所示的序列的任意一种或几种(如表1)。

18、表1 2条靶向timp1可变剪接的sgrna序列

19、 sgrna 正义链(5'-3') 反义链(5'-3') 1 gaaccctttatacatctgttgatggatgag   (seq id no.1) ctcatccatcaacagatgtataaagggttc   (seq id no.2) 2 ggtccaggcactcactgtgcattcctcaca   (seq id no.3) tgtgaggaatgcacagtgagtgcctggacc   (seq id no.4)

20、本发明提出了timp1基因剪接异常作为癌细胞生物标志物的用途。发明人发现，肿瘤细胞中timp1-l表达明显高于癌旁正常组织，而timp1-s表达明显低于癌旁正常组织，timp1-l和timp1-s的比值可作为区分正常细胞和癌细胞的生物标志物。

21、本发明提出了检测timp1-l和timp1-s表达量的试剂在制备试剂盒中的用途，特别是提出了用于检测权利要求1所述的timp1-s或timp1-l表达量的试剂或试剂盒。根据本发明的实施例，相关试剂或试剂盒可用于判断样本来源于正常细胞或癌细胞。癌细胞中timp1促癌亚型timp1-l表达水平显著高于正常细胞，而抑癌亚型timp1-s表达水平显著低于正常细胞。抑制timp1抑癌亚型timp1-l，促进促癌亚型timp1-s表达可抑制癌细胞的生长。由此，通过采用检测timp1-l和timp1-s表达量的试剂对样本进行检测，可以有效地区分出样本来源于正常细胞或是来源于癌细胞。

22、本发明中的试剂可以为本领域常用规定pcr检测试剂。

23、发明人发现，结直肠癌细胞中的timp1促癌亚型timp1-l表达水平显著高于正常细胞，而抑癌亚型timp1-s表达水平显著低于正常细胞，因此timp1剪接作为结直肠癌细胞的生物标志物可信度更高。

24、本发明提出了试剂在制备药物中的用途、timp1基因剪接异常作为结直肠癌生物标志物的用途以及筛选药物的方法，包括但不限于试剂用于促进timp1基因的可变剪接，以及药物用于治疗或预防结直肠癌。通过促进timp1基因的剪接，可以抑制结直肠癌细胞生长，起到治疗或预防结直肠癌的目的。

25、本发明所提供的mrna timp1-s/l，在制备治疗或预防癌症的药物方面，以及在作为生物标志物的检测方面，具有潜在的应用价值。