乳制品中副干酪乳杆菌活菌数字PCR定量检测方法与流程

本发明属于微生物，具体地说，是一种乳制品中副干酪乳杆菌活菌数字pcr定量检测方法。

背景技术：

1、副干酪乳杆菌是一种革兰氏阳性同型发酵乳酸菌，是乳杆菌属的重要成员，广泛存在于人体肠道、传统发酵乳制品和泡菜等环境中。有研究表明，优良的副干酪乳杆菌具有较好的抗胃肠道消化能力等益生特性且对宿主安全。其代谢物如有机酸和细菌素等可抑制病原菌生长。通过胞外酶作用分解蛋白产生的小肽分子具有降血压、抗肿瘤和抗氧化等功能，在健康和功能性食品中得到广泛应用。

2、我国现行有效的乳酸菌定量检测方法标准为gb 4789.35-2016，可采用平板计数法对样品中所有乳酸菌进行计数，检测周期长，且不能对单一种类的乳酸菌进行区分计数，难以满足日益壮大的多元复合乳酸菌产品市场。

3、ddpcr作为一种新兴的检测技术已被成功用于临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测等领域。例如2017年赵丽青等利用微滴式数字pcr技术定量检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌，检出限为(3.6±0.1)copies/20μl。2018年方佩佩等采用ddpcr技术建立副溶血性弧菌快速定量检测，以鳕鱼为样品进行阳性添加，研究表明ddpcr定量检测技术特异性良好、灵敏度高、结果准确。2018年gobert等研究表明ddpcr对较低数量的活细胞的定量效果最好，ddpcr在干扰菌背景下，无需建立标准曲线，就可以对少量活菌细胞进行特异性定量。2020年he l等利用ddpcr同时检测大肠杆菌o157:h7和o104:h4，以stx和o抗原特异性基因为靶基因，通过使用taqman探针对人工污染的苹果汁、牛奶和菠菜洗液进行定量检测。2021年roman netzer等利用数字pcr技术对水产养殖中重点细菌进行绝对定量。上述研究均为乳制品中副干酪乳杆菌的ddpcr检测研究奠定了基础。

技术实现思路

1、为实现对副干酪乳杆菌的特异性检测和绝对定量分析，本申请的发明人选取了副干酪乳杆菌具有种属特异性的蛋白编码序列作为靶序列，分别设计了引物和探针组合。经qpcr验证，选出了一组对于副干酪乳杆菌具有很好的特异性引物和探针，并且经ddpcr验证，用于副干酪乳杆菌检测时具有良好的重复性。

2、为此，本发明的第一个方面，提供了一种乳制品中副干酪乳杆菌活菌数字pcr定量检测方法，使用以下引物和探针序列：

3、正向引物cad a-f：ccgggtgcattggtgatt(seq in no.1)和cctggtgcattggtgatt(seq in no.2)的混合物；

4、反向引物cad a-r：cacatccccgcctttgatc(seq in no.3)；

5、探针cad a-p：cgcccccgtcagcaatgttgtc(seq in no.4)。

6、进一步的，所述数字pcr的反应体系如下：

7、ddpcr master mix for probes(no dutp)10μl，上、下游引物各1.8μl(终浓度900nmol/l)，探针0.5μl(终浓度250nmol/l)，经pma处理并曝光后的样品dna模板2μl，用双蒸水补足总体积20μl；

8、所述数字pcr的扩增反应条件如下：

9、95℃预变性10min；94℃变性30s，55～60℃退火1min，40个循环；98℃固化微滴10min。

10、根据本发明的优选实施例，所述用于处理样品dna的pma的浓度范围在10～30μg/ml。

11、根据本发明的优选实施例，所述曝光的时间为10～20min。

12、根据本发明，所述数字pcr测定结果与对应样品的菌悬液浓度的换算公式如以下式(1)：

13、

14、式(1)中：c1为对应菌悬液浓度(cfu/ml)；n为20μl ddpcr反应体系中测得的核酸拷贝数(拷贝/20μl)；v1为提取核酸的最终定容体积(μl)；v2为ddpcr反应体系中加入的核酸模板体积(μl)；v3为提取的菌悬液体积(ml)。

15、本发明的第二个方面，提供额一种用于乳制品中副干酪乳杆菌活菌数字pcr定量检测的引物和探针，所述引物和探针的序列如下：

16、正向引物cad a-f：ccgggtgcattggtgatt(seq in no.1)和cctggtgcattggtgatt(seq in no.2)的混合物；

17、反向引物cad a-r：cacatccccgcctttgatc(seq in no.3)；

18、探针cad a-p：cgcccccgtcagcaatgttgtc(seq in no.4)。

19、本发明具有以下有益效果：

20、1、本发明的乳制品中副干酪乳杆菌ddpcr定量检测方法具有良好的特异性，同其他常见乳酸菌和食源性致病菌均无交叉反应，最低定量限为9拷贝/20μl。

21、2、本发明的乳制品中副干酪乳杆菌ddpcr定量检测结果与gb 4789.35计数结果无显著统计学差异，适用于添加副干酪乳杆菌的乳制品中副干酪乳杆菌的快速定量检测。

22、3、采用本发明的引物和探针组用于检测时，样品中菌浓度在105cfu/g～107cfu/g范围内的变异系数cv均小于25％，满足国际上对核酸定量方法的验证要求，具有良好的重复性。

技术特征：

1.一种乳制品中副干酪乳杆菌活菌数字pcr定量检测方法，其特征在于，使用以下引物和探针序列：

2.根据权利要求1所述的数字pcr定量检测方法，其特征在于:

3.根据权利要求2所述的数字pcr定量检测方法，其特征在于，所述用于处理样品dna的pma的浓度范围在10～30μg/ml。

4.根据权利要求2所述的数字pcr定量检测方法，其特征在于，所述曝光的时间为15min。

5.根据权利要求1所述的数字pcr定量检测方法，其特征在于，所述数字pcr测定结果与对应样品的菌悬液浓度的换算公式如以下式(1)：

6.一种用于乳制品中副干酪乳杆菌活菌数字pcr定量检测的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的序列如下：

技术总结
本发明公开了一种乳制品中副干酪乳杆菌活菌数字PCR定量检测方法，使用以下引物和探针序列：正向引物cad A‑F：CCGGGTGCATTGGTGATT和CCTGGTGCATTGGTGATT的混合物；反向引物cad A‑R：CACATCCCCGCCTTTGATC；探针cad A‑P：CGCCCCCGTCAGCAATGTTGTC。本发明的乳制品中副干酪乳杆菌ddPCR定量检测方法具有良好的特异性，同其他常见乳酸菌和食源性致病菌均无交叉反应，最低定量限为9拷贝/20μL。采用本发明的引物和探针组用于检测时，样品中菌浓度在10<supgt;5</supgt;CFU/g～10<supgt;7</supgt;CFU/g范围内的变异系数CV均小于25％，满足国际上对核酸定量方法的验证要求，具有良好的重复性。

技术研发人员：张奕南,刘洋,杨捷琳,杨娟,赵磊
受保护的技术使用者：上海市质量监督检验技术研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15