宿主细胞残留DNA检测样本前处理试剂盒及其使用方法与流程

本发明涉及分子生物学，c12n15/10，尤其涉及宿主细胞残留dna检测样本前处理试剂盒及其使用方法。

背景技术：

1、宿主细胞中dna的残留量决定着宿主细胞生物产品的杂质含量和安全性能等，如何精准高效地定量宿主细胞中残留的dna显得非常重要。对于生物制品中微量的dna进行分析，不但要保证去除样品本身的基质干扰物，还要避免操作过程中的交叉污染，并保证提取方法的准确性和精密度。

2、现有对残留dna样品进行前处理的方法存在着众多问题，如(1)对样品数量和质量要求高，(2)dna片段长度和质量差异大，后续重复实验的准确性不高，(3)操作时间长，操作过程繁琐，(4)前处理成本高等等。中国专利cn109957561a公开了一种提取残留dna的方法，该方法中使用了裂解液、糖原、碘化钠、异丙醇等对dna进行处理，其中不涉及有机试剂洗涤步骤，降低了对环境的污染，并解决了试剂盒成本高的问题。但是该方法中dna的提取纯度仍然不高。

3、现有技术在dna提取方面仍然存在很多缺点，因此需要在提高提取效率和纯度，简化操作步骤，降低安全风险等方面进行改进以适应更广泛的需求。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种宿主细胞残留dna检测样本前处理试剂盒，所述试剂盒包括：裂解液、洗涤液、洗脱液、磁珠悬液、蛋白酶k、糖原、酵母trna。

2、进一步地，所述裂解液包括以下浓度的组分：15-30mmol/l的tris-hcl、110-150mmol/l的磷酸酶抑制剂、15-30mmol/l的硫醇类物质、0.5-5mmol/l的na3vo4。

3、进一步地，所述磷酸酶抑制剂选自nacl、naf、na4p2o7、β-甘油磷酸中的至少一种。

4、优选地，所述磷酸酶抑制剂为nacl和/或naf。

5、进一步地，所述裂解液还包括蛋白酶抑制剂。

6、进一步地，所述蛋白酶抑制剂选自aprotinin、leupetin、bestatin、pepstatin、pmsf中的至少一种。

7、优选地，所述蛋白酶抑制剂为aprotinin、leupetin和pmsf。

8、进一步地，所述裂解液的组分还包括0.05-4ug/ml的aprotinin、0.5-3ug/ml的leupetin、0.5-3mmol/l的pmsf。

9、优选地，所述裂解液包括以下浓度的组分：18-25mmol/l的tris-hcl、125-145mmol/l的磷酸酶抑制剂、16-23mmol/l的硫醇类物质、1-4mmol/l的na3vo4、0.05-2.5ug/ml的aprotinin、0.5-2ug/ml的leupetin、0.5-2mmol/l的pmsf。

10、在一种优选的实施方式中，所述裂解液包括以下浓度的组分：20mmol/l的tris-hcl、137mmol/l的磷酸酶抑制剂、20mmol/l的硫醇类物质、2mmol/l的na3vo4、1ug/ml的aprotinin、1ug/ml的leupetin、1mmol/l的pmsf。

11、进一步地，所述硫醇类物质为β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫代赤藓醇中的至少一种。

12、优选地，所述硫醇类物质为二硫苏糖醇。

13、进一步地，所述裂解液还包括np-40，所述np-40在裂解液中的质量分数为0.5-3％，优选为1％。

14、在一种更优选的实施方式中，所述裂解液包括以下浓度的组分：20mmol/l的tris-hcl、137mmol/l的nacl、20mmol/l的二硫苏糖醇、2mmol/l的na3vo4、1ug/ml的aprotinin、1ug/ml的leupetin、1mmol/l的pmsf、质量分数为1％的np-40。其中的mmol/l、ug/ml和1％指相应的组分在裂解液中的摩尔浓度、质量浓度和质量分数。

15、本技术的裂解液中，na3vo4和nacl可抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，维持蛋白质的磷酸化状态；aprotinin、leupetin和pmsf了有效抑制细胞裂解中产生的蛋白酶，以保持蛋白质不被降解，但不同的蛋白酶抑制剂对蛋白质的敏感性不同，只有在裂解液中使用0.05-2.5ug/ml的aprotinin、0.5-2ug/ml的leupetin、0.5-2mmol/l的pmsf的裂解液并配合0.5-3％质量分数的np-40使用时才能最有效地使蛋白酶活力下降、消失，并不使其变性；二硫苏糖醇可还原dna中的二硫键，抑制dna形成二聚体的倾向，提高磁珠对dna的固定效率，另外还促进了蛋白酶k消化组织的作用。通过优化裂解液的组分和浓度，使本技术的试剂盒对dna的提取效率更高，所取得的dna纯度更好。

16、进一步地，所述洗涤液为0.2-3.0mol/l的na2hpo4溶液，优选为0.4-1.0mol/l的na2hpo4溶液；更优选为0.5mol/l的na2hpo4溶液。

17、进一步地，所述洗脱液包括但不限于te buffer、pb buffer中的至少一种。

18、进一步地，所述洗脱液为te buffer；所述te buffer指tris-edta缓冲液，其中tris浓度为10mmol/l，edta浓度为1mmol/l，ph为7.9-8.1。

19、进一步地，所述磁珠悬液中磁珠的浓度为0.8-2mg/ml，优选为1mg/ml。

20、进一步地，所述磁珠为羟基修饰的磁珠，购自himat，型号为hydroxy01-200。

21、进一步地，所述试剂盒中裂解液、洗涤液、洗脱液、磁珠悬液、蛋白酶k需保存在2-8℃的环境下，糖原和酵母trna需保存在-20℃以下的环境中。

22、其次，本发明还提供了一种宿主细胞残留dna检测样本前处理试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

23、s1、将待处理样本加入体积比为(1-3.5)：1的裂解液和蛋白酶k的混合液中，于离心管内漩涡震荡后离心，在50-70℃下孵育10-30min；

24、s2、对s1孵育后的混合体系离心处理，之后依次加入糖原和酵母trna、裂解液、异丙醇、磁珠悬液，漩涡震荡后快速离心；移去上清液后向离心管中加入洗涤液，漩涡震荡将磁珠分散，快速离心；再次移去上清液后，向离心管内加入75-85wt％的乙醇，漩涡震荡、快速离心，静置0.5-2min后移去上清液；

25、s3、对s2离心后的混合体系再次快速离心处理，吸取出残留的乙醇后，对离心管内剩余的物质进行干燥；

26、s4、向s3的离心管中加入洗脱液，漩涡震荡后，在65-80℃下孵育3-12min，孵育期间每2-3min涡旋混匀一次；

27、s5、将s4的离心管高速离心，收集出上清液即可。

28、进一步地，所述待测样本为液体或者干粉。当待测样本为液体，且含有较高dna含量时，可使用pbs对样本稀释后再进行处理，稀释倍数可根据实际情况进行调整，如100倍、1000倍。当待测样本为干粉时，将其稀释成10mg/ml-100mg/ml再进行前处理操作。

29、进一步地，所述待处理样本的ph为6.0-8.0。

30、进一步地，所述s1中待处理样本的体积为50-200μl，优选为100μl。

31、进一步地，所述裂解液和蛋白酶k的体积比为2.5：1。

32、进一步地，所述s1具体为：将100μl待处理样本加入体积比为2.5：1的20-40μl蛋白酶k的混合液中，于离心管内漩涡震荡后离心，在60-68℃下孵育12-20min。

33、在一种更优选的实施方式中，所述s1具体为：将100μl待处理样本加入25μl裂解液和10μl蛋白酶k的混合液中，于离心管内漩涡震荡后离心，在65℃下孵育15min。

34、进一步地，所述s2中糖原、酵母trna、裂解液、异丙醇、磁珠悬液的体积比为(7-10)：(0.1-0.5)：(40-60)：(120-180)：(15-25)。

35、优选地，所述s2中糖原、酵母trna、裂解液、异丙醇、磁珠悬液的体积比为(8.5-9.5)：(0.1-0.3)：(45-55)：(140-160)：(18-22)。

36、更优选地，所述s2中糖原、酵母trna、裂解液、异丙醇、磁珠悬液的体积比为9.0：0.2：50：150：20。

37、进一步地，所述磁珠悬液的体积为待测样本体积的1/3-1/6，优选为1/5。

38、进一步地，所述洗涤液和乙醇的使用体积均为待测样本体积的3-8倍，优选为5倍。

39、进一步地，所述s2具体为：对s1孵育后的混合体系离心处理，之后依次加入9.0μl糖原和0.2μl酵母trna的混合液、50μl裂解液、150μl异丙醇、20μl磁珠悬液，漩涡震荡后快速离心8-15s；移去上清液后向离心管中加入500μl洗涤液，漩涡震荡将磁珠分散，快速离心；再次移去上清液后，向离心管内加入500μl、75-85wt％的乙醇，漩涡震荡、快速离心，静置0.5-2min后移去上清液。

40、进一步地，本技术所采用的移去上清液的方式为：将离心管置于磁力架，轻轻左右转动，待磁珠聚集于贴近磁力架的管壁后，保持离心管固定于磁力架上，用移液枪吸取上清液，过程中不能触碰到磁珠。

41、进一步地，所述s3的干燥采用室温干燥或鼓风干燥，干燥时间可适应性调整，但避免磁珠干燥过重。

42、进一步地，所述s3的干燥为室温干燥时，干燥时间为2-6min；若采用鼓风干燥时，干燥时间为1-3min。

43、进一步地，所述s4中洗脱液的添加体积为待处理样本体积的0.8-3倍，优选为1-1.5倍；优选为1倍。

44、在一种优选的实施方式中，所述s4具体为：向s3的离心管中加入100μl洗脱液，漩涡震荡0.5-2min后，在70℃下孵育7min，孵育期间每2-3min涡旋混匀一次。

45、进一步地，所述s5具体为：将s4的离心管高速离心0.5-2min，之后静置于磁力架上，待磁珠分离后，转移出上清液到新的试剂管中即可。

46、进一步地，所述s1-s5中，离心转速为1000-5000r/min。

47、进一步地，所述试剂盒用于cho细胞、e.coli细胞、vero细胞、human细胞、质粒等中的dna的提取和纯化过程中。

48、有益效果

49、1、相对于传统dna提取方法，本技术dna样本前处理试剂盒大大精简了实验操作，避免了繁琐的步骤和复杂的操作流程，降低了实验难度；

50、2、本技术的dna样本前处理试剂盒利用了表面修饰的磁珠对dna分子进行特异性结合，提高了dna提取的效率，使得提取的dna量更高，更稳定；进一步规定使用具有特定组分和浓度的裂解液，结合过程中规定糖原、酵母trna、裂解液、异丙醇、磁珠悬液的体积比为(7-10)：(0.1-0.5)：(40-60)：(120-180)：(15-25)，有效地减少dna损失和样品残留，提高纯度，从而得到更纯净、更可靠的dna样品；

51、3、本技术的dna样本前处理试剂盒可适用于各种类型的样品如血液、组织、体液、唾液、细胞培养液等，具有很强的适用性和灵活性；且检测快速、专一性强、性能可靠。