一种植物多基因编辑系统及其组装方法

本发明属于生物，具体涉及一种植物多基因编辑系统及其组装方法。

背景技术：

1、基因功能的鉴定和作物新品种的选育离不开突变体的获得。以往突变的获得方式是随机的，大大限制了突变体的使用。基因编辑技术能够在研究者需要的特定位点进行定点突变，从而加快基础研究和应用研究。

2、crispr/cas9系统是目前应用最广的基因编辑系统。天然的crispr/cas9免疫系统中需要1个cas9蛋白和2个可互补的rna元件，即tracrrna和crrna，cas9蛋白可通过crrna识别dna上与之互补的序列。cas9识别dna后，其核酸酶活性可以从pam(proto-spaceradjacent motif)序列上游的第4位碱基切割，形成平端的dna双链断裂(doublestrandbreak,dsb)。只要细胞中表达了cas9蛋白和相应的sgrna，且有该cas9蛋白能识别的pam序列，就能对基因组的任意位置进行切割。dsb可激发编辑受体自身的dna修复系统，包括非同源末端连接(non-homologousend joining,nhej)修复和同源重组(homologousrecombination,hr)修复。nhej途径不够精确，可带来多种方式的变异，引起基因功能的丧失。cas9蛋白是rna引导的核酸酶，这一特性特别有利于多基因编辑，因为增加靶点只需增加相应的sgrna即可。多靶点碱基编辑能够拓宽编辑窗口，带来类型更加多样化的人工变异。

3、对多靶点基因编辑来说，可用多转录元件系统(multicomponenttranscriptional unit system,mctu)，即每个sgrna都使用1个单独的小核rna(smallnuclear rna,snrna)启动子；也可用双转录元件系统(two component transcriptionalunit system,tctu)，即除cas蛋白的转录本之外，再使用单启动子转录一串sgrna阵列，随后通过剪切加工，分离释放。当前，基于crispr/cas9系统的植物多基因编辑已有多种类型的工具包发布。由于mctu系统中每个sgrna均由单独的启动子驱动表达，相互之间不干扰，系统内各sgrna单元的基因敲除效率一般与相应的单基因敲除载体无异。如华南农大刘耀光团队开发的基于mctu的可适用于单子叶和双子叶多基因编辑系统，至多能组装8个靶点的sgrna。中科院上海植生所朱健康团队开发的类似构架的双子叶mctu系统，至多组装6个靶点。马里兰大学戚益平团队开发的单/双子叶mctu系统，采用golden gate precloned模板，无需pcr，但靶点固定(单子叶至多3个，双子叶至多8个)。

4、以上最常用的多靶点基因编辑系统的极限为8个靶点(一般5个以上成功率低)，限制了使用范围。虽然也有升级更新，如刘耀光团队报道的水稻截短型启动子增加该团队多基因编辑系统的靶点上限，但最多也只能达到20个(一般12个以上成功率低)。此外，目前多靶点基因编辑系统构建操作繁琐耗时。pcr构建sgrna表达盒需要做2步融合pcr，一次只能构1个模块；golden gate precloned需要等待菌落生长，如戚益平系统构成需8天，且靶点数锁定。mctu系统使用常规启动子(ii型)如ubi驱动sgrna串联的单转录本的转录，但单个转录本所包含的靶点数是有限的(上限是12个，一般5个)，且因靶点要预先组装到转录元件中，工作量相比mctu减少有限。进一步增加靶点数的方案是多级golden gate克隆或goldengate克隆结合gibson克隆，均有效率低、耗时久的问题和载体过大导致成功率低等问题。因此，简单高效的高效植物多基因编辑系统及其组装方法，对促进并加快大基因家族成员、功能冗余基因、生化通路相关基因、多倍体基因组学等基因工程和生物学的应用十分必要。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种简单高效的植物多基因编辑系统。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种多基因编辑系统，包括模板载体、供体载体组和接受载体；

4、所述模板载体是具有1个以上的名称为sgrna支架-snrna启动子的dna片段的载体，所述sgrna支架-snrna启动子由sgrna支架和位于所述sgrna支架下游的snrna启动子连接而成；

5、所述供体载体组为a1)～a6)中任意一种：

6、a1)包括名称为pgn1101ck、pgn1102ck、pgn1103ck和pgn1104ck的供体载体；

7、a2)包括名称为pgn1101ck和pgn1107ck的供体载体；

8、a3)包括名称为pgn11015ck的供体载体；

9、a4)包括名称为pgn1103ck、pgn1104ck和pgn1106ck的供体载体；

10、a5)包括名称为pgn1102ck、pgn1103ck、pgn1104ck和pgn1108c的供体载体；

11、a6)包括名称为pgn1107ck和pgn1108c的供体载体；

12、所述pgn1101ck、pgn1102ck、pgn1103ck、pgn1104ck、pgn1106ck、pgn1107ck和pgn1108c均包括两个gateway的重组位点，所述pgn1101ck、pgn1102ck、pgn1103ck、pgn1104ck、pgn1106ck、pgn1107ck还包括位于所述两个gateway的重组位点之间的snrna启动子、自杀基因和sgrna支架，所述pgn1108c还包括位于所述两个gateway的重组位点之间的玉米启动子，所述自杀基因和所述玉米启动子的两端具有iis型限制性核酸内切酶位点；所述pgn1101ck的两个gateway的重组位点为attl1和attr5，所述pgn1102ck的两个gateway的重组位点为attl5和attl4，所述pgn1103ck的两个gateway的重组位点为attr4和attr3，所述pgn1104ck的两个gateway的重组位点为attl3和attl2，所述pgn1105ck的两个gateway的重组位点为attl1和attl2，所述pgn1106ck的两个gateway的重组位点为attl1和attl4，所述pgn1107ck的两个gateway的重组位点为attl5和attl2，所述pgn1108c的两个gateway的重组位点为attl1和attl5；

13、所述接受载体含有gateway的重组位点attr1和attr2，cas蛋白的编码基因或cas融合蛋白的编码基因。

14、所述系统可为组合物，具体可为多个载体的组合物。所述snrna启动子为snrna(small nuclear rna,小核rna)基因的启动子。所述snrna启动子可为天然的snrna启动子(来源于生物(如水稻)的snrna基因的启动子)或增强型snrna启动子(将天然的snrna基因的启动子进行突变得到的启动子活性高于所述天然的snrna启动子的启动子)。

15、所述天然的snrna启动子包括posu6a、posu6b、posu6c和posu3中的一种或多种。

16、所述增强型snrna启动子包括pmosu6a、pmosu6b、pmosu6c和pmosu3中的一种或多种。

17、上述模板载体中的多个snrna启动子可为pmosu6a、pmosu6b、pmosu6c、pmosu3、posu6a、posu6b、posu6c和posu3的任意一种或多种。

18、sgrna是由sgrna支架(scaffold)和与靶向序列互补的区域(spacer)构成的rna。sgrna支架为sgrna的3’端的一段具有茎环(stem-loop)结构的支架序列(scaffoldsequence)，该序列和cas9蛋白带正电的凹槽相互作用形成核糖核蛋白复合物(ribonucleoprotein complex,rnp)。

19、所述sgrna支架可为天然的sgrna支架(来源于生物(如水稻)的sgrna支架)或突变型sgrna支架(将天然的sgrna支架进行突变得到的sgrna支架)。所述突变型的sgrna支架的核苷酸序列为seq id no.1中第408-511位碱基，所述天然的sgrna支架的核苷酸序列为seqid no.2中第425-528位碱基。

20、上述模板载体中的多个sgrna支架可以均为天然的sgrna支架，也可均为突变型sgrna支架，也可为天然的sgrna支架和突变型sgrna的混合。

21、所述模板载体、供体载体组和接受载体均含有载体所需的其它元件，如细菌抗生素选择标记基因和复制子(ori)。所述模板载体的细菌抗生素选择标记基因可为氨苄霉素抗性基因(ampr)，所述供体载体组的细菌抗生素选择标记基因可为氯霉素抗性基因(cmr)和或卡那霉素抗性基因(kan r)，所述接受载体的细菌抗生素选择标记基因可为卡那霉素抗性基因(kan r)。

22、所述供体载体中的snrna启动子可以为pmosu6a、pmosu6b、pmosu6c、pmosu3、posu6a、posu6b、posu6c、posu3和强组成型玉米pzmubi启动子中的任意一种。

23、所述供体载体中的sgrna支架与所述模板载体中的sgrna支架可相同，为天然的sgrna支架或突变型sgrna支架。

24、所述cas融合蛋白可为具有碱基编辑功能、转录抑制功能、转录激活功能和/或表观遗传修饰功能的且含有所述cas蛋白的融合蛋白质。

25、所述cas蛋白(crispr相关的内切酶)可为cas9、cas9n(cas9(d10a))、dcas9、xcas9。所述cas融合蛋白可为dsteme-ng、pco-dcas9-3x(srdx)或pco-dcas9-vp64；所述dsteme-ng含有所述cas蛋白和碱基编辑酶，所述碱基编辑酶为胞苷脱氨酶和/或腺苷脱氨酶。

26、dsteme-ng中cas9为核酸酶缺陷的cas9，突变h840a在hnh结构域和d10a在ruvc结构域失去切割活性，但不阻止与dna结合，识别的protospacer adjacent motif(pam)为ng。cas9融合的蛋白包括腺嘌呤脱氨酶可将靶位点处一定范围的腺嘌呤(adenine,a)脱氨变成次黄嘌呤(hypoxanthine)，次黄嘌呤可与胞嘧啶(c)配对，在dna水平会被当作鸟嘌呤(guanine,g)进行读码与复制，最终实现a至g或t至c的替换；胞嘧啶脱氨酶对ssdna上一定范围内的胞嘧啶(cytosine,c)进行脱氨基反应，将c变为尿嘧啶(uracil,u)，进而通过dna修复或复制将u转变为胸腺嘧啶(thymine,t)，最终实现c至t或g至a的直接替换以及尿嘧啶dna糖基化酶抑制剂(uracil dna glycosylase inhibitor,ugi)。ugi通过抑制udg而减少对碱基u的切除修复，进而增加碱基替换效率。

27、dsteme-ng基于雌激素受体的化学诱导系统，该系统由编码细菌抑制因子lexa的dna结合结构域(dbd)组成的嵌合转录激活剂；vp16的酸性反式活化结构域和人类雌激素受体的羧基区域(er)组成，含lexadbd的因子的二聚化，随后与靶dna的结合可以被融合在其上的异源调控元件严格调控。er序列包含调控区域，包括细胞调控复合物和雌激素的结合位点，与转录激活功能2(taf2)结构域重叠。含有lexa操纵子序列融合在px 35s启动子上以控制靶基因的转录。

28、dcas9-vp64是vp64激活域与dcas9的c端融合蛋白，不仅可以激活报告基因，还可以激活被沉默的内源基因或者上调可转录基因的转录量。

29、dcas9-3x(srdx)是dcas9的c端与srdx的转录阻遏结构域融合并成功用于植物细胞中内源基因的转录抑制。

30、所述a1)可以实现4个dna序列的lr重组反应，所述a2)可以实现2个dna序列的lr重组反应，所述a3)可以实现1个dna序列的lr重组反应，所述a4)可以实现3个dna序列的lr重组反应，所述a5)可以实现4个dna序列的lr重组反应，所述a6)可以实现2个dna序列的lr重组反应，结合不同的接受载体，可以实现前述dna序列的敲除、碱基替换、表达增强或表达抑制。前述单个dna序列可以容纳多个含有靶基因的靶位点的sgrna表达盒(即新型编辑模块(nem))，本发明实施例中最多可容纳13个含有靶基因的靶位点的sgrna表达盒，本领域技术人员也可根据现有技术及本发明的提示容纳更多或更少的sgrna表达盒，该数量不应作为本发明的限制。

31、需要说明的是，根据所用目的和方法，所述接受载体是多基因组装过程中装载外源目的基或基因片段的载体，在植物转化中使用时是转化表达载体，包括以农杆菌介导转化的双元载体以及适合其它转化方法(基因枪轰击法等)的表达载体；在其它生物中使用时是具有相应载体骨架和元件的载体。

32、进一步地，上述多基因编辑系统，所述模板载体含有3个以上所述sgrna支架-snrna启动子，所述模板载体中相邻的所述sgrna支架-snrna启动子之间的转录方向相反；不相邻的所述sgrna支架-snrna启动子之间的转录方向相同或相反，相同转录方向的所述sgrna支架-snrna启动子之间至少间隔1000bp。

33、优选的，上述间隔1000bp是为了将同一个模板载体上扩增出的第一个sgrna-第一个snrna启动子与第一个sgrna-第三个snrna启动子的扩增产物区分开。以pgn3701a为例(图2)，避免扩增出即避免从pmosu6a的grna scoffold处直接扩增至pmosu6c的grnascoffold。

34、进一步地，上述多基因编辑系统，所述的模板载体包括pgn3701a和pgn3702a；

35、所述pgn3701a具有4个串联的所述sgrna支架-snrna启动子，所述sgrna支架的核苷酸序列为seq id no.1中408-511位碱基，所述snrna启动子为pmosu6a、pmosu6b、pmosu6c和pmosu3；

36、所述pgn3702a具有4个串联的sgrna支架-snrna启动子，所述sgrna支架的核苷酸序列为seq id no.1中第425-528位碱基，所述snrna启动子为posu6a、posu6b、posu6c和posu3。

37、所述pgn3701a中pmosu6a的核苷酸序列如seq id no.1中第516-738位碱基所示；

38、所述pgn3701a中pmosu6b的核苷酸序列如seq id no.1中第2437-2625位碱基所示；

39、所述pgn3701a中pmosu6c的核苷酸序列如seq id no.1中第5538-5731位碱基所示；

40、所述pgn3701a中pmosu3的核苷酸序列如seq id no.1中第8174-8343位碱基所示；

41、所述pgn3702a中posu6a的核苷酸序列如seq id no.2中第4273-4715位碱基所示；

42、所述pgn3702a中posu6b的核苷酸序列如seq id no.2中第1321-1649位碱基所示；

43、所述pgn3702a中posu6c的核苷酸序列如seq id no.2中第558-1295位碱基所示；

44、所述pgn3702a中posu3的核苷酸序列如seq id no.2中第3863-4244位碱基所示。

45、进一步地，上述多基因编辑系统，所述attl1是一条链的核苷酸序列为seq idno.3中第2024-2123位核苷酸；所述attl2是一条链的核苷酸序列为序列是seq id no.9的双链dna片段；所述attl3是一条链的核苷酸序列为序列是seq id no.8的双链dna片段；所述attl4是一条链的核苷酸序列为序列是seq id no.5的双链dna片段；所述attl5是一条链的核苷酸序列为序列是seq id no.4的双链dna片段；所述attr1是一条链的核苷酸序列为序列是seq id no.11的双链dna片段；所述attr2是一条链的核苷酸序列为序列是seq idno.12的双链dna片段；所述attr3是一条链的核苷酸序列为序列是seq id no.7的双链dna片段；所述attr4是一条链的核苷酸序列为序列是seq id no.6的双链dna片段；所述attr5是一条链的核苷酸序列为序列是seq id no.3中第4275-4398位核苷酸的双链dna片段。

46、进一步地，上述多基因编辑系统，所述cas融合蛋白为dsteme-ng、pco-dcas9-3x(srdx)或pco-dcas9-vp64；所述dsteme-ng含有所述cas9蛋白和碱基编辑酶，所述碱基编辑酶为胞苷脱氨酶和/或腺苷脱氨酶；所述pco-dcas9-vp64含有dcas9和具有转录激活作用的蛋白质；所述pco-dcas9-3x(srdx)含有dcas9和具有转录抑制作用的蛋白质。

47、所述cas9的编码基因的核苷酸序列为质粒pgn1201kc的自5'端起第2368-6468位碱基所示；

48、所述dsteme-ng的编码基因的核苷酸序列为质粒pgn1202kc的自5'端起第7057-13830位碱基所示；

49、所述pco-dcas9-3x(srdx)的编码基因的核苷酸序列为由质粒pgn1204kc的自5'端起第375位到第638位碱基、3x(srdx)的核苷酸序列和质粒pgn1204kc的自5'端起第776到第5427位碱基按序组成的核苷酸序列；

50、所述pco-dcas9-vp64的编码基因的核苷酸序列为质粒pgn1204kc的自5'端起中第375-5247位碱基所示。

51、所述iis型限制性核酸内切酶为bsai。

52、除此之外，上述系统还可包括引物设计软件gogo，gogo软件由python语言编写，gui由qt设计师制作。源代码可在github(https://github.com/lyokoiiiyyr/gogo)上找到。只需输入靶点序列并定义供体载体和启动子，即可输出相对应的引物序列。如果靶点序列包含bsai识别位点ggtctc，gogo将给出错误。gogo会根据系统的输入信息和默认设置，将靶点序列拆分成所有可能的悬垂组合，从而设计引物。在这个过程中，回文或低保真的突出端会首先被去除，然后具有相同、相似(4个碱基中有3个相同)、反向互补的突出端组合中的相似序列将被去除。

53、具体而言，本发明中的系统包括8个供体载体，2个模板载体，4个接受载体以及引物设计软件gogo。2类模板载体分别命名为pgn3701a、pgn3702a；8类供体载体分别命名为pgn1101ck、pgn1102ck、pgn1103ck、pgn1104ck、pgn1105ck、pgn1106ck、pgn1107ck、pgn1108c；4类接受载体pgn1201kc、pgn1202k、pgn1203kc、pgn1204kc；

54、模板载体pgn3701a通过如下步骤制备得到：golden gate克隆，组装好4个不同的dna片段，a(包含msgrna支架+pmosu6a+pcmylcv+egfp)，b(ta3+pmosu6b+msgrna支架+pnos)，c(gus+tnos+msgrna支架+pmosu6c)，d(dact+dhyg+pmosu3+msgrna支架)，片段a通过saci和bamhi双酶切后，克隆到saci和bamhi双酶切后的puc57-pcmylcv，得到puc57+a；片段b通过bamhi酶切后，克隆到bamhi酶切后的puc57-a，得到puc57-a-b；片段c通过sali酶切后，克隆到sali酶切后的puc57-a-b，得到puc57-a-b-c；片段d通过kpni酶切后，克隆到kpni酶切后的puc57-a-b-c，得到终载体pgn3701a；

55、模板载体pgn3702a通过如下步骤制备得到：扩增sgrna+posu6c序列、g418表达盒，通过ecori和hind iii双酶切后，克隆到ecori和hind iii双酶切后的puc57-pcmylcv，得到puc57-u6c-g418；扩增sgrna+posu6a序列，通过bamhi单酶切后，克隆到bamhi单酶切后的puc57-u6c-g418，得到puc57-u6c-g418-u6a；扩增sgrna+posu6b序列，通过kpni单酶切后，克隆到kpni单酶切后的puc57-u6c-g418-u6a，得到

56、puc57-u6c-u6b-g418-u6a；扩增sgrna+posu3序列，通过hpai单酶切后，克隆到hpai单酶切后的puc57-u6c-u6b-g418-u6a，得到pgn3702a。

57、供体载体为pgn1101ck通过如下步骤制备得到：以pggaselect为骨架载体，goldengate克隆，使用bsmbi限制性内切酶，连接attl1、posu6a、ccdb、msgrna支架、attr5序列，得到pgn1101ck，ccdb的两端是type iis内切酶bsai位点，产生5’悬垂caac/gttt；

58、供体载体为pgn1102ck通过如下步骤制备得到：以pggaselect为骨架载体，goldengate克隆，使用bsmbi限制性内切酶，连接attl5、posu3、ccdb、msgrna支架、attl4序列，得到pgn1102ck，ccdb的两端是type iis内切酶bsai位点，产生5’悬垂tgcc/gttt；

59、供体载体为pgn1103ck通过如下步骤制备得到：以pggaselect为骨架载体，goldengate克隆，使用bsmbi限制性内切酶，连接attr4、posu6c、ccdb、msgrna支架、attr3序列，得到pgn1103ck，ccdb的两端是type iis内切酶bsai位点，产生5’悬垂ctga/gttt；

60、供体载体为pgn1104ck通过如下步骤制备得到：以pggaselect为骨架载体，goldengate克隆，使用bsmbi限制性内切酶，连接attl3、posu3、ccdb、msgrna支架、attl2序列，得到pgn1104ck，ccdb的两端是type iis内切酶bsai位点，产生5’悬垂tgcc/gttt；

61、供体载体为pgn1105ck通过如下步骤制备得到：以pggaselect为骨架载体，goldengate克隆，使用bsmbi限制性内切酶，连接attl1、posu6c、ccdb、msgrna支架、attl2序列，得到pgn1105ck，ccdb的两端是type iis内切酶bsai位点，产生5’悬垂ctga/gttt；

62、供体载体为pgn1106ck通过如下步骤制备得到：以pggaselect为骨架载体，goldengate克隆，使用bsmbi限制性内切酶，连接attl1、posu3、ccdb、msgrna支架、attl4序列，得到pgn1106ck，ccdb的两端是type iis内切酶bsai位点，产生5’悬垂ggca/gttt；

63、供体载体为pgn1107ck通过如下步骤制备得到：以pggaselect为骨架载体，goldengate克隆，使用bsmbi限制性内切酶，连接attl5、posu3、ccdb、msgrna支架、attl2序列，得到pgn1107ck，ccdb的两端是type iis内切酶bsai位点，产生5’悬垂tgcc/gttt；

64、供体载体为pgn1108c通过如下步骤制备得到：以pggaselect为骨架载体，goldengate克隆，使用bsmbi限制性内切酶，连接attl1、pzmubi、attr5序列，得到pgn1108c，玉米ubiquitin基因启动子的两端是type iis内切酶bsai位点，产生5’悬垂acca/gatt。

65、接受载体pgn1201kc通过如下步骤制备得到：组装中间的连接片段attr1-ccdb-attr2，骨架载体pylcrisprcas9pubi-h用bsai酶切，通过同源重组的方式克隆到pylcrisprcas9pubi-h，得到pgn1201kc；

66、接受载体pgn1202k通过如下步骤制备得到：骨架载体ph-steme-ng-esgrna中ncas9-ng(d10a)进行点突变，使其突变为dcas9-ng，得到的dsteme，使cas9无内切酶活性；组装片段a，attr1-ccdb-attr2以及融合lexa操纵子的px 35s启动子，驱动腺嘌呤-胞嘧啶二元碱基编辑器(steme)融合蛋白的表达，骨架载体dsteme用spei和bstbi双酶切，通过同源重组的方式克隆到dsteme，得到dsteme-a；组装片段b，由玉米pubi驱动化学诱导元件表达序列，骨架载体dsteme-a用spei酶切，通过同源重组的方式克隆到dsteme-a，得到pgn1202k；

67、接受载体pgn1203kc通过如下步骤制备得到：组装中间的连接片段attr1-ccdb-attr2，骨架载体pcambia1300，用ecori酶切，通过同源重组的方式克隆到pcambia1300，得到pc1300-rcr；组装中间的连接片段a，从pypq152扩增pco-dcas9-vp64片段，骨架载体pc1300-rcr，用ecori酶切，通过同源重组的方式克隆到pc1300-rcr，得到pgn1203kc；

68、接受载体pgn1204kc通过如下步骤制备得到：组装中间的连接片段attr1-ccdb-attr2，骨架载体pcambia1300，用ecori酶切，通过同源重组的方式克隆到pcambia1300，得到pc1300-rcr；组装中间的连接片段a，从pypq153扩增pco-dcas9-3x(srdx)片段，骨架载体pc1300-rcr，用ecori酶切，通过同源重组的方式克隆到pc1300-rcr，得到pgn1204kc。

69、本发明还保护上述多基因编辑系统的如下应用：

70、g1)培育转基因水稻；

71、g2)培育转基因菌株；

72、g3)进行多基因敲除；

73、g4)进行多基因的碱基编辑；

74、g5)提高多基因的表达量；

75、g6)降低多基因的表达量。

76、本发明还保护上述多基因编辑载体系统的组装方法，包括如下步骤：

77、(1)根据前述的模板载体的sgrna支架-snrna启动子设计正向引物和反向引物；在所述正向引物的5'端添加靶基因的靶序列，在所述反向引物的5'端添加靶序列的反向互补序列，所述反向互补序列用于连接相邻的两个sgrna支架-snrna启动子；

78、(2)以所述模板载体为模板，利用所述正向引物和所述反向引物扩增得到含有名称为sgrna表达盒的dna片段的pcr产物；

79、(3)通过所述iis型限制性核酸内切酶介导的golden gate克隆使多个sgrna表达盒串联在同一个前述的供体载体组中任一个供体载体上，得到含有重组供体载体；

80、(4)将多个所述重组供体载体利用gateway特异重组反应串联至受体载体的t-dna区域中，得到含有多个靶基因的植物表达载体。

81、本发明提供的多基因编辑载体组装方法中重组供体载体中包含12～13个靶基因的sgrna表达盒。每个sgrna表达盒的长度约为400bp，不同sgrna表达盒在重组供体载体上的间距约为2kb。长度的显着差异确保了即使用相同的模板，构建不同类型nem的pcr也不会相互干扰。

82、所述基因编辑包括敲除、碱基编辑、转录抑制或转录激活。

83、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

84、本发明包括8类供体载体、4类接受载体、2类模板载体、以及引物设计软件gogo，该载体系统结合golden gate克隆在多重复片段组装方面的优势和gateway克隆在大片段组装方面的优势，首先利用gogo设计组装编辑靶点的扩增引物，通过一步pcr扩增目的片段，其次通过bsai介导的消化连接或golden gate克隆，获得携带多个sgrna表达盒的供体载体，最后通过高效的gateway lr反应将每个供体载体组装到目的载体的t-dna区域中，即可获得植物表达载体。通过提供4种目的载体携带cas9蛋白，dcas9融合双胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器，dcas9和srdx融合蛋白，或dcas9和vp64融合蛋白，以适应不同转基因操作，包括敲除、碱基编辑、转录抑制或转录激活。本发明是目前最简单高效的多基因编辑载体系统。因此本植物编辑系适用于多基因敲除、多基因高强度调控和双饱和单碱基编辑，可应用于如多倍体植物改良、多成员基因家族编辑、复杂代谢通路研究等，具有重要应用价值，对促进并加快大基因家族成员、功能冗余基因、生化通路相关基因、多倍体基因组学等基因工程和生物学的应用十分必。