犬细小病毒中和单域抗体的筛选及应用

本发明属于生物，具体涉及犬细小病毒抗体的筛选及应用，尤其涉及犬细小病毒中和单域抗体的筛选及应用。本发明还涉及编码这些抗体和抗体片段的核酸、载体和表达所述抗体核酸的宿主细胞。此外，本发明也涉及包含本发明抗体的组合物的应用。

背景技术：

1、犬细小病毒(canine parvovirus，cpv)是细小病毒科细小病毒属中的一种无囊膜单链dna病毒。病毒的直径为21～24nm，基因组大小约为5.2kb，且含有2个开放阅读框(orf)，分别编码结构蛋白(vp1和vp2)和非结构蛋白(ns1和ns2)。虽然cpv是一种dna病毒，但其呈现出非常高的变异速率，可达到约10-4个位点/年，与rna病毒的变异速率相似，从而出现快速和持续的抗原进化和变异。犬细小病毒-1(cpv-1)通常被称为犬微小病毒，与犬细小病毒-2(cpv-2)在基因上无关，而cpv-2是引起犬/幼犬肠胃炎的主要肠道病原体之一，cpv-2为无包膜病毒，具有二十面体衣壳，含有单链dna。

2、在衣壳中，vp2是主要的衣壳蛋白，决定了病毒的抗原性。该病毒起源于猫泛白细胞减少症病毒(fpv)的宿主范围变种。cpv-2是一种高度致命的传染性病毒，可导致急性出血性腹泻，导致全世界频繁死亡(幼犬>70％，成年犬<1％)和100％的发病率。患有细小病毒感染的犬只表现出高发病率(100％)和死亡率(幼犬>70％，成年犬<1％)。犬细小病毒感染的治疗方法是支持性治疗，包括药物治疗、抗生素治疗、止吐治疗、抗病毒治疗、辅助治疗和饮食管理。

3、cpv-2a、cpv-2b和cpv-2c是犬细小病毒的三种主要的亚型。1980年初，cpv-2a被认为是在狗身上发现的主要细小病毒。1984年，新亚型cpv-2b首次在美国出现，然后在世界范围内传播，可在犬、猫和野生食肉动物中引起严重的胃肠炎和心肌炎。cpv-2c是该病毒的第三种变种，并于2000年在意大利首次被发现，并迅速地传播到欧洲、美洲、亚洲和澳大利亚。据报道，cpv-2c已成为引发全球犬类细小病毒病的主要变种。cpv-2亚型之间的主要抗原差异是vp2表位a中426残基的关键氨基酸差异；其中，cpv-2a中的残基为天冬酰胺，cpv-2b中的残基为天冬氨酸，cpv-2c中的残基为谷氨酸。

4、cpv的生命力较为顽强，可在4～10℃生存半年，37℃存活14d，56℃存活24～36h，60℃可以存活1h，在粪便中可存活数月乃至数年，仍可引发感染。此外，cpv的传染能力强，所有犬科动物在各年龄阶段均可感染，但1～6月龄的犬只感染率最高。犬细小病毒病在临床上主要表现为肠炎型、心肌炎型和混合型。肠炎型多发生在2～6月龄小犬，表型症状为嗜睡，没有食欲，精神沉郁，呕吐和腹泻，死亡比例非常高。心肌炎型常见于4～6周龄的幼犬，无明显病症,发病急死亡快，致死率为60％～100％。给易感动物接种疫苗，诱导产生特异性的抵抗力是预防该病的主要手段。

5、疫苗防控该疾病是目前预防该疾病的最佳手段，但市场上应用最多的是cpv-2的弱毒疫苗，弱毒疫苗存在毒株变异和毒力返强的风险，可能存在母源抗体的影响导致免疫失败。随着该病毒的变异已经衍生出cpv-2a，cpv-2b，cpv-2c等多种变体，因而疫苗保护效力逐渐弱化，那么有效的治疗手段，是现在需要迫切关注的方向；因此，仍有很多幼犬感染cpv，抗体治疗是治疗该病的首选。

6、目前，在犬细小病毒病治疗方面主要是通过抗病毒药物和犬细小病毒的高免血清联合使用，但多数病例还是以死亡为最终结局。抗体药物是现在比较可行的一种方案，经中和性单抗的筛选可以获得中和病毒的药物，而且使用结构生物学的方法，可以方便的获取cpv的中和位点，获得针对cpv各个亚型的广谱性治疗药物，从而达到缓解或治疗的作用。而单域抗体片段vhh是源自骆驼中没有轻链的天然抗体的小抗原结合结构域。它们为生物技术应用提供了许多优势，例如微生物的高生产水平和高理化稳定性。此外，由于其单个基因性质，vhh非常适合噬菌体展示免疫文库中各种抗原结合vhh的选择。vhh也可以轻松地以多价产生，以通过多价结合改善抗原结合亲和力或效力，或构建双特异性重组抗体，与两种无关抗原结合。

7、目前通过小鼠杂交瘤技术，已有多个鼠源单抗报道可以抑制cpv病毒的复制能力。例如殷相平等人筛选了一株针对vp2的单抗，可以产生病毒抑制的作用，且单抗浓度为0.5ug-1ug便可发挥作用。而h·詹l·阮e·拉特克利夫的专利则开发了犬、猫源化单克隆细小病毒抗体能够用于预防和/或治疗诸如狗和猫等受试者的细小病毒感染的方法。但传统抗体不易重组表达的特性限制了其的应用。而贾红等人通过噬菌体筛选技术(噬菌体库容量为2×106cfu/ml)获得了具有cpv-2c特异性的纳米抗体，但纳米抗体不具有中和活性。

8、因而我们通过病毒纯化，骆驼免疫，外周血pbmc提取等，构建更高的噬菌体库容量，筛选出针对cpv-2a病毒的高特异性、敏感性和中和活性的纳米抗体。

技术实现思路

1、第一方面，本发明提供一种犬细小病毒中和单域抗体或其抗原结合片段，所述单域抗体或抗原结合片段分别含有重链可变区cdr1 cdr1和cdr3，所述每种抗体或抗原结合片段的cdr1 cdr1和cdr3分别为如下氨基酸序列：

2、抗体1：seq id no.1、seq id no.49和seq id no.97；

3、抗体2：seq id no.2、seq id no.50和seq id no.98；

4、抗体3：seq id no.3、seq id no.51和seq id no.99；

5、抗体4：seq id no.4、seq id no.52和seq id no.100；

6、抗体5：seq id no.5、seq id no.53和seq id no.101；

7、抗体6：seq id no.6、seq id no.54和seq id no.102；

8、抗体7：seq id no.7、seq id no.55和seq id no.103；

9、抗体9：seq id no.8、seq id no.56和seq id no.104；

10、抗体10：seq id no.9、seq id no.57和seq id no.105；

11、抗体12:seq id no.10、seq id no.58和seq id no.106；

12、抗体13:seq id no.11、seq id no.59和seq id no.107；

13、抗体14:seq id no.12、seq id no.60和seq id no.108；

14、抗体15:seq id no.13、seq id no.61和seq id no.109；

15、抗体17:seq id no.14、seq id no.62和seq id no.110；

16、抗体18:seq id no.15、seq id no.63和seq id no.111；

17、抗体19:seq id no.16、seq id no.64和seq id no.112；

18、抗体20:seq id no.17、seq id no.65和seq id no.113；

19、抗体21:seq id no.18、seq id no.66和seq id no.114；

20、抗体22:seq id no.19、seq id no.67和seq id no.115；

21、抗体24:seq id no.20、seq id no.68和seq id no.116；

22、抗体25:seq id no.21、seq id no.69和seq id no.117；

23、抗体26:seq id no.22、seq id no.70和seq id no.118；

24、抗体27:seq id no.23、seq id no.71和seq id no.119；

25、抗体29:seq id no.24、seq id no.72和seq id no.120；

26、抗体30:seq id no.25、seq id no.73和seq id no.121；

27、抗体31:seq id no.26、seq id no.74和seq id no.122；

28、抗体32:seq id no.27、seq id no.75和seq id no.123；

29、抗体33:seq id no.28、seq id no.76和seq id no.124；

30、抗体34:seq id no.29、seq id no.77和seq id no.125；

31、抗体35:seq id no.30、seq id no.78和seq id no.126；

32、抗体36:seq id no.31、seq id no.79和seq id no.127；

33、抗体39:seq id no.32、seq id no.80和seq id no.128；

34、抗体40:seq id no.33、seq id no.81和seq id no.129；

35、抗体42:seq id no.34、seq id no.82和seq id no.130；

36、抗体43:seq id no.35、seq id no.83和seq id no.131；

37、抗体44:seq id no.36、seq id no.84和seq id no.132；

38、抗体45；seq id no.37、seq id no.85和seq id no.133；

39、抗体46:seq id no.38、seq id no.86和seq id no.134；

40、抗体47:seq id no.39、seq id no.87和seq id no.135；

41、抗体48:seq id no.40、seq id no.88和seq id no.136；

42、抗体49:seq id no.41、seq id no.89和seq id no.137；

43、抗体50:seq id no.42、seq id no.90和seq id no.138；

44、抗体51:seq id no.43、seq id no.91和seq id no.139；

45、抗体52:seq id no.44、seq id no.92和seq id no.140；

46、抗体53:seq id no.45、seq id no.93和seq id no.141；

47、抗体54:seq id no.46、seq id no.94和seq id no.142；

48、抗体55：seq id no.47、seq id no.95和seq id no.143；

49、和抗体56：seq id no.48、seq id no.96和seq id no.144。

50、进一步的，所述犬细小病毒中和单域抗体或其抗原结合片段优选如下一组或多组抗体：

51、抗体2：seq id no.2、seq id no.58和seq id no.114；

52、抗体10：seq id no.9、seq id no.57和seq id no.105；

53、抗体12:seq id no.10、seq id no.58和seq id no.106；

54、抗体42:seq id no.34、seq id no.82和seq id no.130；

55、抗体43:seq id no.35、seq id no.83和seq id no.131；

56、抗体45；seq id no.37、seq id no.85和seq id no.133；

57、抗体47:seq id no.39、seq id no.87和seq id no.135；

58、抗体48:seq id no.40、seq id no.88和seq id no.136；

59、和抗体55：seq id no.47、seq id no.95和seq id no.143。

60、进一步的，所述犬细小病毒中和单域抗体或其抗原结合片段优选如下一组或多组抗体：

61、抗体12:seq id no.10、seq id no.58和seq id no.106；

62、抗体42:seq id no.34、seq id no.82和seq id no.130；

63、抗体43:seq id no.35、seq id no.83和seq id no.131；

64、和抗体47:seq id no.39、seq id no.87和seq id no.135。

65、其中，所述重链可变区cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别为seq id no.1～seqid no.48所示、seq id no.49～seq id no.96所示和seq id no.97～seq id no.144所示；具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性或不超过8个氨基酸的变体。

66、进一步的，所述抗原结合片段包括但不限于fab、fab’、f(ab’)2、fv、单链fv(scfv)、单链fab、双体抗体(diabody)、单结构域抗体或单域抗体(sdab，纳米抗体)、骆驼科ig、ignar、f(ab)'3片段、双-scfv、(scfv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)。

67、进一步的，所述单域抗体或抗原结合片段的重链恒定区选自猪igg、人igg和/或鸡igy。

68、进一步的，所述重链恒定区igg包括igg1、igg2a、igg2b和/或igg4。

69、进一步的，所述犬细小病毒选自cpv-2a株。

70、第二方面，本发明提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码如本发明第一方面所述的犬细小病毒中和单域抗体或其抗原结合片段。

71、第三方面，本发明提供一种或包含犬细小病毒中和单域抗体或其抗原结合片段的核酸分子的重组载体或宿主细胞。

72、进一步的，所述的载体选自dna、rna、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

73、更进一步的，所述病毒载体选自慢病毒、腺病毒、aav病毒、逆转录病毒、或其组合。

74、进一步的，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

75、更进一步的，所述的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、噬菌体、或其组合。

76、进一步的，所述原核细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、链霉菌、奇异变形菌、或其组合。

77、进一步的，所述真核细胞包括但不限于巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉、草地粘虫等昆虫细胞、烟草等植物细胞、bhk细胞、cho细胞、cos细胞、骨髓瘤细胞、或其组合。

78、第四方面，本发明提供一种嵌合抗体，所述嵌合抗体包含本发明第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段。

79、第五方面，本发明提供包含本发明所述犬细小病毒中和单域抗体或其抗原结合片段的融合物或缀合物，所述抗体融合或缀合于异源分子而产生融合物或缀合物。

80、进一步的，所述融合物或缀合物由本发明犬细小病毒中和单域抗体或其抗原结合片段的多肽与一个或多个异源分子融合或缀合，其中所述异源分子包括但不限于蛋白多肽/肽、标记物、药物、和细胞毒性剂。

81、第六方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包含本发明的单域抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体或宿主细胞、嵌合抗体和/或融合物或缀合物。

82、第七方面，本发明提供一种单域抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体或宿主细胞、嵌合抗体、融合物或缀合物和/或本发明所述的组合物在制备诊断、预防和/或治疗病毒感染药物中的应用。

83、进一步的，所述病毒感染选自犬细小病毒。

84、第八方面，本发明提供一种检测塞内卡病毒a的试剂盒，所述试剂盒包括说明书和检测试剂，所述检测试剂为可检测本发明涉及的单域抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体或宿主细胞、嵌合抗体、融合物或缀合物和/或本发明所述的组合物的试剂。

85、有益效果：

86、本发明所涉及的中和单域抗体其免疫原性风险低，能有效阻断cpv病毒感染f81细胞，具有很好的亲和性和特异性，且具有显著的cpv中和活性；因此，本发明提供的纳米抗体序列及表达载体在sva鉴定中和表位、预防或治疗、诊断中具有很好的应用。