一种基于微流控芯片细胞培养阵列的体液肿瘤细胞扩增方法

本技术涉及医学诊断和细胞生物学，尤其是涉及一种基于微流控芯片细胞培养阵列的体液肿瘤细胞扩增方法。

背景技术：

1、体液中肿瘤细胞的检测是实现肿瘤诊断与伴随诊断的重要工具。目前检测这些肿瘤细胞的方法主要是基于肿瘤细胞的生物标志物或物理特征。但目前还没有一种公认的生物标志物或物理特性可绝对区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞。

2、干细胞样肿瘤细胞，即肿瘤干细胞(tumor stem cells,tscs)，是肿瘤细胞中的一小群性质独特但决定肿瘤性质和命运的细胞。这类细胞具有自我更新、多向分化潜能、极强的成瘤能力以及对于理化损伤因素超强的耐受力，是肿瘤转移、复发、耐药的重要原因。tscs由于具备自我更新和抗凋亡能力，可在非贴附和无血清培养条件下形成肿瘤球，而其它肿瘤细胞则不可在这种条件下扩增或长期培养。因此可利用该条件实现对tscs的选择性扩增。体液中tscs的选择性扩增对于肿瘤诊断具有重要价值：一方面，tscs选择性扩增可避免传统体液肿瘤细胞检测对于生物标志物的依赖，并且tscs来源肿瘤球的形成是确切的恶性肿瘤诊断证据；另一方面，tscs选择性扩增伴有肿瘤细胞的增加，因而允许利用扩增细胞进行多种测试。

3、微流控芯片具有设计灵活的规模集成的特点和优势。高密度微流控芯片细胞培养阵列，能对肿瘤细胞进行充分的分散，因而消除细胞自发性聚集；此外，微流控芯片细胞培养阵列还可以将肿瘤细胞限制在一个固定的位置，便于肿瘤细胞跟踪观察以及定性/定量检测。

4、概括来讲，基于高密度微流控芯片细胞培养阵列的体液肿瘤细胞选择性扩增方法具有以下特点和优势：1.基于肿瘤细胞的生物学本质特性对肿瘤干细胞进行选择性扩增，能提供确切的肿瘤细胞检测证据，并且避免细胞标志物带来的灵敏度特异性不足；2.基于选择性扩增方法实现体液中肿瘤干细胞的定性定量检测；3.检测的同时伴有细胞扩增，因而可以获得足够量的细胞样品，以对接后续的基因分析、细胞实验、药物反应测试，有利于个体化诊断与治疗。

5、但是，现有阵列芯片仅适用于细胞系样品或小体积的组织样品(如细胞系或小体积组织样品)，细胞种类的纯度要比较高，背景干扰要较小；因为这些芯片培养池数量和储液空间有限，不适用于大体积的血液、腹水、胸水等体液样品，尤其是血液样品，这些体液样品中，细胞数量和种类都极高，如果要通过选择性扩增的方法培养肿瘤干细胞，则每个培养微池都已经塞满细胞，细胞没有空间进行扩增和营养交换。以血液样品为例，每毫升血液包含约5×106个细胞，其中肿瘤细胞约<10个，肿瘤干细胞则可能更少；且血液背景较复杂，包含大量不同种类的细胞和代谢物。要获得足够量的肿瘤干细胞，则需至少处理2ml以上的血液，并且处理掉大量的非肿瘤细胞。常见的微流控阵列芯片只能设计1×104数量级的培养阵列，且可处理样品体积最多只能达到微升级别。如此狭小的空间，并不适合长期培养体液样品中大量的细胞，并对肿瘤干细胞进行选择性扩增。

6、因此本技术提供一种高密度、高通量的培养阵列，并搭配开放式的储液池，可处理2ml及以上的血液样品，并对1×106及以上数量级的细胞进行长期培养。

技术实现思路

1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于微流控芯片细胞培养阵列的体液肿瘤细胞扩增方法。该方法能不依赖标志物对体液中的肿瘤干细胞进行准确的定性定量检测、扩增和回收。这种检测方法还有利于对接后续多种肿瘤细胞分析手段，为肿瘤个体化精准诊断和治疗提供一种可行的途径。

2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：

3、第一方面，本技术提供了一种基于微流控芯片细胞培养阵列的体液肿瘤细胞扩增方法，包括以下步骤：

4、1)在微流控芯片的表面覆盖一层亲水涂层，获得处理后的微流控芯片；

5、2)取体液样品经红细胞裂解处理后，重悬，制备肿瘤细胞悬液；

6、3)将肿瘤细胞悬液引入步骤1)获得的处理后的微流控芯片中，分散于微坑阵列；

7、4)使用不含血清的干细胞培养基对微坑阵列中的细胞连续培养，然后对微流控芯片进行扫描成像，确定肿瘤球的形成及其数目；

8、5)回收微坑阵列中的肿瘤球，利用回收的肿瘤球进行多种后续分析。

9、本技术的扩增方法利用肿瘤干细胞的抗凋亡与自我更新特性对其进行选择性扩增和检测，因而避免了现有体液肿瘤干细胞检测技术对于细胞标志物的依赖。微流控芯片细胞选择性扩增产生的肿瘤球不仅为恶性肿瘤诊断提供参考信息，而且还可以利用扩增细胞进行多种分析，满足肿瘤个体化精准诊断的需求。本技术利用肿瘤干细胞可在无血清、非贴附的条件下形成肿瘤球，而其它细胞则会在该条件下发生失巢凋亡，进而提供可靠的肿瘤诊断信息。采用本技术体液肿瘤细胞扩增方法可以获得具有活性的肿瘤干细胞，允许对接后续各种细胞分析手段，有可能为肿瘤诊断提供更为充分的信息。

10、其中，利用微流控细胞培养阵列，一方面可以避免传统的平板或悬浮细胞培养导致的细胞自发聚集，从而无法确认细胞团是否由肿瘤干细胞扩增而来，另一方面便于对肿瘤干细胞来源的肿瘤球准确定量。

11、作为本技术所述基于微流控芯片细胞培养阵列的体液肿瘤细胞扩增方法的优选实施方式，述步骤1)，将四甲基乙二胺、过硫酸钾加入至n,n-二甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油脂纯水混合物中反应，透析，收集透析产物，灌入微流控芯片，获得处理后的微流控芯片。

12、作为本技术所述基于微流控芯片细胞培养阵列的体液肿瘤细胞扩增方法的优选实施方式，所述微流控芯片包括上层滤膜、中层储液池和下层微坑阵列，所述下层微坑阵列包含50000个深度为120μm的微坑，微坑为边长为75μm的正六边形。

13、本技术包含中层储液池(开放式储液池)，一方面能提高处理样品体积的上限，另一方面能提供足够量的培养基和空间以供密集的细胞生长。

14、将肿瘤细胞分散于微坑阵列，一方面可以避免传统的平板或悬浮细胞培养导致的细胞自发聚集，另一方面便于对肿瘤干细胞来源的肿瘤球准确定量。

15、优选地，所述中层储液池和下层微坑阵列为聚二甲基硅氧烷(pdms)材料，上层滤膜为3μm孔径聚碳酸酯滤膜。

16、作为本技术所述基于微流控芯片细胞培养阵列的体液肿瘤细胞扩增方法的优选实施方式，所述裂解时间为7～10min。优选地，所述裂解时间为7min。

17、本技术利用模拟样品，针对肿瘤细胞保留率、活性和成球率，对红细胞裂解时间进行优化。

18、其中3min、5min存在裂解不完全的情况，无法统计标记细胞保留数，也无法统计标记细胞的活性，也无法统计标记细胞的成球率。7min、10min的细胞保留率、细胞活性无显著差异。当裂解时间为7～10min时肿瘤的成球率均较高。

19、当裂解时间为7min时，可以更好地保证肿瘤干细胞扩增的成功率。

20、作为本技术所述基于微流控芯片细胞培养阵列的体液肿瘤细胞扩增方法的优选实施方式，所述干细胞培养基包括以下浓度的组分：

21、dmem/f12培养基、1～10μg·ml-1胰岛素、10～25ng·ml-1表皮生长因子、10～25ng·ml-1碱性成纤维细胞生长因子、1×b27、0.2～0.8％w/v牛血清白蛋白、10～100u·ml-1青霉素和10～100μg·ml-1链霉素。

22、优选地，所述干细胞培养基包括以下浓度的组分：dmem/f12培养基、5μg·ml-1胰岛素、20ng·ml-1表皮生长因子、20ng·ml-1碱性成纤维细胞生长因子、1×b27、0.4％w/v牛血清白蛋白、100u·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素。

23、本技术采用上述不含血清的干细胞培养基可以选择性扩增或检测具有抗凋亡与自我更新特性的肿瘤干细胞，避免现有体液肿瘤干细胞检测技术对于细胞标志物的依赖，所形成的肿瘤球可以提供可靠的肿瘤诊断信息。

24、作为本技术所述基于微流控芯片细胞培养阵列的体液肿瘤细胞扩增方法的优选实施方式，所述细胞悬液中含有肿瘤细胞或肿瘤细胞系细胞。

25、作为本技术所述基于微流控芯片细胞培养阵列的体液肿瘤细胞扩增方法的优选实施方式，所述体液样品包括血液、胸水、腹水、尿液、脑脊液中的一种。

26、作为本技术所述基于微流控芯片细胞培养阵列的体液肿瘤细胞扩增方法的优选实施方式，所述步骤4)中，对微流控芯片进行扫描成像，计算>30μm的肿瘤球数量，实现肿瘤干细胞定量。

27、第二方面，本技术提供上述体液肿瘤细胞扩增方法获得的肿瘤干细胞在构建类器官中的应用。

28、作为本技术所述应用的优选实施方式，所述类器官用于药物反应测试。

29、与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：

30、本技术提供了一种基于微流控芯片细胞培养阵列的体液肿瘤细胞扩增方法。本技术利用肿瘤干细胞的抗凋亡与自我更新特性对其进行选择性扩增和检测，所形成的肿瘤球可以提供可靠的肿瘤诊断信息；该方法避免了现有体液肿瘤干细胞检测技术对于细胞标志物的依赖，可以实现对体液中的肿瘤干细胞进行准确的定性定量检测、扩增和回收。这种扩增或检测方法还有利于对接后续多种肿瘤细胞分析手段，有可能为肿瘤诊断提供更为充分的信息，为肿瘤个体化精准诊断和治疗提供一种可行的途径。