假禾谷镰刀菌FpMCoL蛋白及其编码基因与应用

本发明属于生物，具体涉及fpmcol蛋白及其编码基因与应用。

背景技术：

1、由假禾谷镰刀菌(fusarium pseudograminearum)引起的小麦茎基腐病(wheatcrown rot，wcr)是小麦生产中重要的土传病害，主要症状表现为小麦根茎基部变褐腐烂，严重的可引起苗枯和白穗。小麦茎基腐病在澳大利亚、美国、加拿大等国家均有发生且危害严重，正常年份，小麦茎基腐病造成小麦平均产量损失约9.5％，大流行年份可达35％。近年，该病害在黄淮海冬麦区普遍发生，并呈现逐年加重趋势，目前，该病害在河南、河北两省的病田率分别高达65.1％和81.4％，已经严重威胁小麦的安全生产。

2、镁(magnesium)是生物生长发育必需的核心营养元素之一，也是细胞中含量最多的两价阳离子。镁具有最大的水合半径，最小的离子半径和最大的电荷密度，其在酶的活化，基因组稳定，抑制衰老，减轻铝害和调节氮代谢等方面有重要作用，因此，镁离子特殊的理化性质和生物功能使其在生物体内的转运方式显得尤为重要。钴抗性蛋白家族cora属于通道孔类转运体中的一螺旋通道亚类跨膜转运体，是大型的二价金属离子转运体超家族的主要成员。家族蛋白广泛分布于革兰氏阳性、阴性菌、蓝藻、古细菌以及酵母中，是镁离子、镍离子、钻离子等二价阳离子吸收、转运和外排的调节系统；是生物体保持胞内镁离子稳态最主要的转运系统，该系统缺失会严重影响生物体的生长、发育。

技术实现思路

1、本发明开展以假禾谷镰刀菌的金属二价阳离子转运蛋白mit_cora-like(metalion transporter cora-like divalent cation transporter superfamily)同源蛋白fpmcol功能的相关研究工作，将为更深入的理解假禾谷镰刀菌金属二价阳离子转运系统在调控病菌生长发育及其与寄主互作过程中的作用，以及为新型防治真菌靶标的设计提供参考和借鉴。

2、发明人研究发现，假禾谷镰刀菌中的fpmcol蛋白及其编码基因对于假禾谷镰刀菌的菌丝生长速率、分生孢子产生和致病力密切相关。这些结果表明，假禾谷镰刀菌中的fpmcol蛋白对于病原菌的生长发育和致病过程都具有重要的调控作用。以fpmcol蛋白的基因开发作为病原真菌假禾谷镰刀菌的分子药剂靶标，具有重要的应用前景。

3、因此，本发明的目的之一，提供假禾谷镰刀菌cora同源蛋白，并将其命名为fpmcol，来源于假禾谷镰刀菌菌株2035，是如下a1)或a2)a3)或a4)的蛋白质：

4、a1)氨基酸序列是如seq id no.2所示的蛋白质；

5、a2)在如seq id no.2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；

6、a3)将如seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的，具有相同功能的如seq id no.2所示的蛋白衍生的蛋白质；

7、a4)与如seq id no.2所示的氨基酸序列相似性在75％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上，且具有与如seq id no.2所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。

8、为了使a1)中的蛋白便于纯化，可在如seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上poly arg(rrrrr)、poly his(hhhhhh)、flag(dykddddk)、strep tag ii(wshpqfek)、c myc(eqkliseedl)等标签。

9、上述a1)-a4)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a1)-a4)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中seq id no.1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上述标签的编码序列得到。

10、其中，a1)中，序列表中seq id no.2(fpmcol蛋白)由377个氨基酸残基组成。

11、本发明目的之二是提供编码所需的fpmcol蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、hnrna或trna等。

12、其中，上述fpmcol蛋白的编码基因如下b1)或b2)或b3)：

13、b1)序列表中seq id no.1所述的核苷酸序列所示的dna分子；

14、b2)与b1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码上述fpmcol蛋白的cdna分子或dna分子；

15、b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述fpmcol蛋白的cdna分子或dna分子。

16、上述编码基因，序列表中seq id no.1由2044个核苷酸组成；自seq id no.1的5’端第1-102位，154-201位，265-275位，550-738位，793-980位，1303-1322位，1376-1807位，1863-1976位，2015-2044位核苷酸为编码序列，编码序列表中seq id no.2所示的蛋白fpmcol。

17、所述的rna分子，是所述的编码基因转录得到的rna分子；

18、优选的，所述rna分子的序列为如下c1)或c2)：

19、c1)如seq id no.1所示的dna序列转录的rna序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如seq id no.1所示的dna序列转录的rna序列相同功能的rna序列；

20、c2)如seq id no.1所示的dna序列转录的rna序列。

21、如本发明的dna序列在严格条件下与如seq id no.1所示dna序列能够进行分子杂交且编码如seq id no.2所示蛋白的dna序列。上述严格条件可为用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

22、本发明目的之三是提供以上所述核酸分子相关的生物材料，包括重组载体、表达盒、重组微生物或转基因植物细胞系。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体；所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌；所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。具体的可为如下为下述d1)至d10)中的任一种：

23、d1)含有seq id no.1的表达盒；

24、d2)含有seq id no.1的重组载体、或含有d1)所述表达盒的重组载体；

25、d3)含有seq id no.1的重组微生物、或含有d1)所述表达盒的重组微生物、或含有d2)所述重组载体的重组微生物；

26、d4)含有seq id no.1的转基因植物细胞系、或含有d1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

27、d5)含有seq id no.1的转基因植物组织、或含有d2)所述表达盒的转基因植物组织；

28、d6)含有seq id no.1的转基因植物器官、或含有d2)所述表达盒的转基因植物器官；

29、d7)抑制seq id no.1所示的基因表达的核酸分子；

30、d8)含有d7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；

31、d9)抑制上述rna分子翻译的核酸分子；

32、d10)产生d9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

33、本发明中，编码所述蛋白fpmcol的核苷酸序列可插入到表达载体中形成重组表达载体中。术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本发明中的表达载体不局限于下述实施例中提到的载体，本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码蛋白fpmcol的核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

34、本发明目的之五是提供假禾谷镰刀菌fpmcol蛋白及编码fpmcol蛋白的核酸分子或含有编码fpmcol蛋白的核酸分子的生物材料的应用。

35、所述应用为下述1)-4)中任一种或几种：

36、1)在调控(提高或降低)假禾谷镰刀菌菌丝生长速率中的应用；

37、2)在调控(提高或降低)假禾谷镰刀菌分生孢子产量中的应用；

38、3)在调控(提高或降低)假禾谷镰刀菌对寄主的致病性中的应用；

39、4)在抑制和/或杀灭假禾谷镰刀菌中的应用。

40、优选的，其中，所述应用中，包括通过抑制seq id no.1所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制所述的rna分子的翻译，或抑制和/或灭活seq id no.2所述的fpmcol蛋白的活性来实现1)-4)所述的应用。

41、所述应用中，通过抑制如上述的编码基因的转录，或抑制上述的rna序列的翻译，或抑制和/或失活上述fpmcol蛋白的活性来干扰菌丝的生长速率、影响分生孢子产量和调控侵染寄主能力，从而能够抑制和/或杀灭假禾谷镰刀菌的生长。

42、本发明目的之六是提供seq id no.2所示的fpmcol蛋白或seq id no.1所示的编码基因在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选假禾谷镰刀菌抑菌或杀菌剂中的应用。

43、本发明目的之七是提供一种筛选或辅助筛选假禾谷镰刀菌和/或杀菌剂的方法。

44、所述方法包括将待检测物应用于假禾谷镰刀菌，当所述待检测物能够抑制如上dna序列的转录，或抑制如上rna序列的翻译，或抑制和/或失活如上所示的fpmcol蛋白，则所述待测物质为候选的假禾谷镰刀菌抑菌和/或杀菌剂。

45、本发明目的之八是提供一种降低假禾谷镰刀菌的活性的方法，包括下述步骤：抑制如上述的编码基因的转录或使其缺失，或抑制所述的rna分子的翻译，或抑制和/或失活如上所述的fpmcol蛋白的活性。

46、其中，所述降低假禾谷镰刀菌的活性为降低假禾谷镰刀菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性，和/或者降低假禾谷镰刀菌的菌体生长速度，和/或抑制假禾谷镰刀菌分生孢子产量。

47、上述方法中，通过所述抑制或降低待抑制活性或待灭活的蛋白的编码基因表达来实现蛋白的灭活，具体的，可通过基因敲除或通过基因沉默实现。

48、所述基因敲除是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。

49、所述基因沉默是指在不损伤原有dna的前提下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活，包括反义rna、共抑制、基因压抑、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。

50、优选的，通过使假禾谷镰刀菌中序列表中seq id no.1所示的基因进行基因敲除，以使所述序列表中seq id no.2所示的蛋白质所示的蛋白质灭活；

51、在本发明的一个实施方式中，使上述基因进行基因敲除的方法是基于peg转化的同源重组基因敲除法。

52、具体的，基于peg转化的同源重组基因敲除法是依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、潮霉素抗性基因序列(hph基因序列)和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体。

53、抑制fpmcol蛋白质表达和/或活性的物质在制备植物假禾谷镰刀菌杀菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。

54、上述应用中，所述抑制fpmcol蛋白质表达和/或活性的物质为抑制fpmcol蛋白质表达和/或抑制fpmcol蛋白质的编码基因的转录和/或抑制fpmcol蛋白质的编码基因转录得到的rna分子的翻译的物质。

55、本发明的有益效果：

56、本发明发现，fpmcol蛋白及其编码基因在假禾谷镰刀菌自身生长发育过程中起作用。利用peg转化的同源重组基因敲除法获得的敲除转化子，其生长发育较野生型菌株有明显变化，主要包括：fpmcol基因敲除导致菌丝生长速率减慢、分生孢子产量降低、以及侵染寄主植物的能力变弱。因此，假禾谷镰刀菌中fpmcol蛋白及其编码基因在假禾谷镰刀菌营养生长、无性生殖及侵染寄主等多个过程均可发挥重要作用。本发明为假禾谷镰刀菌的致病机制研究提供了技术支持，并为未来新型杀菌剂的研发提供了潜在的分子作用靶标。