一种抗CD20的纳米抗体及其应用的制作方法

：本发明涉及肿瘤治疗领域，具体地，本发明涉及一种靶向cd20纳米抗体、含有该纳米抗体序列的嵌合抗原受体及表达该嵌合抗原受体的t细胞(car-t细胞)，其可用于肿瘤细胞免疫治疗。

背景技术：

1、cd20属于非糖基化磷蛋白，能够调节b淋巴细胞的增殖和分化。cd20在大部分正常组织中表达受限，仅在前b淋巴细胞、未成熟b淋巴细胞、成熟b淋巴细胞和激活的b淋巴细胞中表达。然而，cd20高表达是b细胞淋巴瘤的重要分子特征，其在超过95％的b细胞淋巴瘤中高表达，而且容易被抗体识别结合，因此cd20是b细胞淋巴瘤理想的治疗靶点。

2、纳米抗体又称单域抗体，由骆驼科动物(包括骆驼、羊驼及其近亲物种)缺失轻链的天然重链抗体的可变区(vhh)组成，与普通抗体相比，纳米抗体除了缺少轻链之外，其重链可变区与铰链区之间没有ch1区，只包含一个重链可变区和两个常规的ch2与ch3区。纳米抗体具有分子量小，亲和力和稳定性高、免疫原性较低、可溶性高和穿透力强等特性，目前广泛用于抗体免疫及细胞免疫治疗。

3、嵌合抗原受体修饰的t细胞(car-t)是一种人工修饰的t淋巴细胞。car结构从n端到c端依次包括抗体结合区、铰链-跨膜区、共刺激结构域以及激活结构域。因此car-t细胞同时具有抗体的靶向作用和t淋巴细胞的效应杀伤能力。car-t细胞疗法已经在一部分血液肿瘤治疗中取得了突破性进展，目前已有多款car-t细胞产品获批上市。然而，目前嵌合抗原受体的研究还有一些不足，在car-t细胞治疗中存在复发率高、安全性低等问题。因此，本领域迫切需要开发特异性好、疗效稳定、副作用小的嵌合抗原受体。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种靶向cd20的纳米抗体，嵌合抗原受体、car-t细胞及应用；所述靶向cd20的纳米抗体及嵌合抗原受体能够特异性结合cd20抗原，所述靶向cd20的car-t细胞可以靶向杀伤cd20高表达的肿瘤细胞。

2、在本发明的第一方面，提供了一种抗人cd20纳米抗体，所述抗体具有seq id no：1所示的氨基酸序列。其框架区为seq id no:2所示的fr1，seq id no:3所示的fr2，seq idno:4所示的fr3，seq id no:5所示的fr4；其互补决定区为seq id no:6所示的cdr1，seq idno:7所示的cdr2，seq id no:8所示的cdr3。

3、在本发明的第二方面，提供了一种核酸，编码所述的seq id no:1纳米抗体的核苷酸序列如seq id no:9所示。根据本发明的实施例，所述核酸为编码前面所述纳米抗体的核酸或其互补序列。根据本发明实施例的核酸特异性编码前面所述的纳米抗体，所述纳米抗体能够特异性靶向结合cd20。

4、需要说明的是，对于本发明权利要求书和说明书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本权利要求书和说明书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的基因序列包括dna形式或rna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。

5、在本发明的第三方面，本发明提供了一种靶向cd20的嵌合抗原受体，其特征在于，从n端到c端包括顺次连接的cd8a信号肽、纳米抗体、strepii标签、cd8a铰链区,cd28跨膜区、cd28功能区，4-1bb功能区和cd3ζ功能区，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq idno.24所示。

6、在本发明的第四方面，本发明提供了编码所述的嵌合抗原受体的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.25所示。

7、在本发明的第五方面，本发明提供了一种靶向cd20的嵌合抗原受体t细胞。

8、本发明提供的所述的纳米抗体、编码所述纳米抗体的基因、所述的嵌合抗原受体、编码所述嵌合抗原受体的基因、所述的嵌合抗原受体t细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

9、本发明的有益效果：本发明提供的靶向cd20的纳米抗体序列与cd20抗原有较强的结合能力。本发明制备的靶向cd20的嵌合抗原受体t细胞对cd20阳性的肿瘤细胞有较强的杀伤作用

技术特征：

1.一种抗cd20的抗体，其特征在于，所述抗体具有seq id no：1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体为纳米抗体。

3.一种核酸，其特征在于，所述核酸为：编码权利要求1所述抗体的核酸或其互补序列。

4.一种核酸，其特征在于：所述核酸的核苷酸序列如seq id no:9所示或者seq id no:9所示序列的互补序列。

5.一种靶向cd20的嵌合抗原受体，其特征在于，从n端到c端依次为信号肽、权利要求1或2所述的抗体、strepii标签、铰链-跨膜区、至少一个共刺激结构域以及激活结构域。

6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no.24所示。

7.编码权利要求5所述的嵌合抗原受体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.25所示。

8.一种靶向cd20的car-t细胞，其特征在于，其修饰为表达根据权利要求5所述的嵌合抗原受体。

9.权利要求1或2所述的抗体、权利要求3或4所述的编码所述纳米抗体的基因、权利要求5或6所述的嵌合抗原受体、权利要求7所述的编码所述嵌合抗原受体的基因、权利要求8所述的car-t细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，所述肿瘤是b细胞淋巴瘤。

技术总结
本发明公开了一种靶向CD20的纳米抗体，该抗体具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明还涉及一种CD20嵌合抗原受体蛋白，从N端到C端依次为：信号肽、本发明的纳米抗体(VHH)、StrepII标签、铰链‑跨膜区、至少一个共刺激结构域以及激活结构域。这种嵌合抗原受体可用于构建本发明的CAR‑T细胞，该CAR‑T细胞可特异性识别CD20抗原阳性的靶细胞并具有特异性杀伤作用。

技术研发人员：张同存
受保护的技术使用者：武汉波睿达生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16