用于检测F8基因倒位的核酸产品及其应用的制作方法

本发明涉及生物，特别是涉及一种用于检测f8基因倒位的核酸产品及其应用。

背景技术：

1、f8基因突变可导致x染色体连锁隐性遗传的甲型血友病。甲型血友病是一种常见的遗传性出血性疾病，全球约有40万例以上的患者或携带者，其中在男性新生儿中的发生率约为1/5000。

2、由于血浆中凝血因子ⅷ的功能活性不同，甲型血友病患者的临床严重程度具有较大差异性。根据ⅷ因子残余活性可分类为：轻度ha（5iu/dl~40iu/dl，或正常值的5%~40%），中等ha（1iu/dl~5iu/dl，或正常值的1%-5%）和重度ha（<1iu/dl，或<正常值的1%）。凝血因子ⅷ是一种血浆糖蛋白，相对分子质量为267kd，是凝血级联反应中一种重要的辅助因子。

3、f8基因是凝血因子ⅷ的编码基因，定位于x染色体长臂末端（x.q28），呈反向排列，全长186kb，包含26个外显子及25个内含子，2315个氨基酸。其突变异质性较丰富；且f8基因位于x染色体端粒端，包含gc含量高的区域，易发生甲基化胞嘧啶脱胺突变；因此加大了通过基因诊断甲型血友病的难度。

4、f8基因突变可造成凝血因子ⅷ的数量或活性降低，从而影响凝血级联反应，造成凝血功能障碍。目前，甲型血友病仍无有效的根治方案，只能通过定期补充凝血因子ⅷ缓解病情的发展；同时，通过孕前、胚胎前及产前诊断进行干预，预防患儿出生，可大大降低家庭及社会压力。因此，对先证者的致病基因突变进行鉴定至关重要。

5、甲型血友病f8基因包括多种致病突变类型。大约三分之二的ha患者具有母系遗传的致病变异体，而另外三分之一的ha患者具有新发的变异体。如第22号内含子倒位、第1号内含子倒位、点突变（包括无义突变）和小缺失等。研究表明，在2401例甲型血友病（轻、中、重度）患者中，大片段重复（>50bp）的发生率约为0.46%（11/2401），而inv22、inv1、错义突变、移码突变、无义突变和剪接突变的发生率分别为24.1%、0.83%、46.4%、10.2%、6.2%和3.0%。

6、f8基因倒位是一种结构变异，发生倒位的片段可以是几个核苷酸也可以是大规模的染色体片段。倒位可以通过截断目标基因（或多个基因）或通过重新排列局部邻近的调控元件，从而对基因表达和转录产生不成比例的影响。

7、第1号内含子倒位和第22号内含子倒位占甲型血友病患者的40%~50%；这些内含子倒位是由位于f8位点的两个长重复序列（第22号内含子中的int22h-1和第1号内含子中的int1h-1）之间的染色体内同源重组引起的，前者的长度为9.1kb，在距离端粒约500kb~580kb处有两个额外的同源物（int22h-2和int22h-3），后者的长度约为1kb，在距离端粒141kb处有一个同源物；上述两个重复序列都容易发生染色体内同源重组，导致中间序列反转，从而使f8分裂成转录方向相反的两个部分；上述倒位突变导致产生无功能的fviii蛋白，从而在临床上引起严重的甲型血友病表型。

8、f8基因的第13号内含子倒位至14号内含子倒位可导致较大的基因序列重排，使中间序列发生反转，从而引起正常等位基因表达不足，最终影响蛋白功能；但是目前尚不清楚第13号内含子倒位至第14号内含子倒位是否为同源重组所致，且尚无有效的方法能够对第13号内含子倒位至第14号内含子倒位进行检测。

技术实现思路

1、基于此，本发明提供了一种能够检测f8基因的第13号内含子至第14号内含子倒位的核酸产品及其应用。具体技术方案如下：

2、根据本发明的一个方面，提供了一种用于检测f8基因倒位的核酸产品，所述核酸产品包括核苷酸序列如seq id no.7和seq id no.9所示的第一引物对，和/或

3、核苷酸序列如seq id no.15和seq id no.16所示的第二引物对。

4、在其中一个实施例中，所述核酸产品还包括核苷酸序列如seq id no.5和seq idno.6所示的第三引物对。

5、在其中一个实施例中，所述核酸产品通过如下方法中的一种或多种来检测所述倒位：

6、普通pcr扩增法、测序法和实时荧光定量pcr法。

7、根据本发明的另一个方面，提供了上述的核酸产品在制备检测甲型血友病的试剂盒中的应用。

8、根据本发明的另一个方面，提供了一种用于检测甲型血友病的试剂盒，包括上述的核酸产品。

9、在其中一个实施例中，所述试剂盒中还包括核酸提取试剂、pcr反应试剂、测序试剂、电泳检测试剂、阴性对照品和阳性对照品中的至少一种。

10、在其中一个实施例中，所述pcr反应试剂包括扩增缓冲液、dntps、dna聚合酶和mg2+中的至少一种。

11、根据本发明的另一个方面，提供了一种非诊断目的的检测f8基因倒位的方法，包括如下步骤：

12、以待测样本的dna为模板，使用上述的核酸产品或者上述的试剂盒进行pcr扩增，得到扩增产物；及

13、对所述扩增产物进行分析，以确定所述f8基因的倒位情况。

14、在其中一个实施例中，对所述扩增产物进行分析的步骤包括：对所述扩增产物进行测序，将所述测序的结果与f8基因的野生型序列进行比对分析。

15、在其中一个实施例中，所述待测样本包括血液gdna。

16、与传统技术相比，本发明具有如下有益效果：

17、本发明通过对f8基因的野生型序列进行模拟重建，针对重建后的片段分别设计靶向chrx:154148973~154170318（inv）突变的两个断点的第一引物对和第二引物对。上述引物对能够特异性地检测出f8基因中第13号内含子至第14号内含子是否发生倒位、以及倒位断点的具体位置，为携带有chrx:154148973~154170318（inv）突变的甲型血友病患者的诊断或预后提供新思路。

技术特征：

1.一种用于检测f8基因倒位的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括核苷酸序列如seq id no.7和seq id no.9所示的第一引物对，和/或

2.根据权利要求1所述的用于检测f8基因倒位的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品还包括核苷酸序列如seq id no.5和seq id no.6所示的第三引物对。

3.根据权利要求1~2任一项所述的用于检测f8基因倒位的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品通过如下方法中的一种或多种来检测所述倒位：

4.权利要求1~3任一项所述的核酸产品在制备检测甲型血友病的试剂盒中的应用。

5.一种用于检测甲型血友病的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3任一项所述的核酸产品。

6.根据权利要求5所述的用于检测甲型血友病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括核酸提取试剂、pcr反应试剂、测序试剂、电泳检测试剂、阴性对照品和阳性对照品中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的用于检测甲型血友病的试剂盒，其特征在于，所述pcr反应试剂包括扩增缓冲液、dntps、dna聚合酶和mg2+中的至少一种。

8.一种非诊断目的的检测f8基因倒位的方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的非诊断目的的检测f8基因倒位的方法，其特征在于，对所述扩增产物进行分析的步骤包括：对所述扩增产物进行测序，将所述测序的结果与f8基因的野生型序列进行比对分析。

10.根据权利要求8或9所述的非诊断目的的检测f8基因倒位的方法，其特征在于，所述待测样本包括血液gdna。

技术总结
本发明提供了一种用于检测F8基因倒位的核酸产品及其应用；所述核酸产品包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9所示的第一引物对，和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的第二引物对。上述第一引物对和第二引物对均能够特异性地检测出F8基因中第13号内含子至第14号内含子倒位突变，为携带有chrX:154148973~154170318（inv）突变的甲型血友病患者的诊断或预后提供新思路。

技术研发人员：钟娟芳,杜娟,何文斌,林戈,李汶,张前军
受保护的技术使用者：中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/5