一种能精准诱导肿瘤细胞焦亡的重组质粒及其应用

本发明属于基因工程，涉及一种能精准诱导肿瘤细胞焦亡的重组质粒及其应用。

背景技术：

1、细胞焦亡是一种由gasdermin家族介导新的的程序性细胞死亡方式，其特征为依赖于炎性半胱天冬酶(主要是caspase-1，4，5，11)，细胞焦亡伴有大量促炎症因子的释放。细胞焦亡释放的肿瘤相关抗原可以在癌症治疗中引起有效的免疫反应。但由于快速清除和非特异性生物分布导致细胞焦亡诱导剂的应用仍然存在一些挑战。因此，开发高效和肿瘤特异性的细胞焦亡策略对于促进癌症免疫治疗至关重要。自2015年以来，邵峰院士等人发现，caspase-1和caspase-11/4/5是通过切割一个叫做gasdermin-d(gsdmd)的蛋白而诱发细胞焦亡的，gsdmd被caspase-1或caspase-11/4/5切割后，释放出其n端结构域，该结构域具有结合膜脂并在细胞膜上打孔的活性，这样就导致细胞渗透压的变化而发生胀大直至最终细胞膜的破裂。目前已经有案例通过基因工程表达质粒选择性表达gsdmd-n活性片段用于一些疾病的治疗，但是这种直接在细胞表达活性片段缺乏特异性，存在风险，容易对正常组织细胞造成误伤。

2、综上所述，亟需提供一种表达仿生gsdmd蛋白的重组质粒及纳米载体，实现gsdmd的充分表达和肿瘤特异性细胞焦亡，对正常细胞无损伤，增强癌症免疫治疗的效果。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种能精准诱导肿瘤细胞焦亡的重组质粒及其应用，首次构建了sox4转录因子调控的表达焦亡蛋白的质粒，通过基因工程的手段构建gsdmd基因的特异性表达重组质粒，使其在小鼠结直肠癌细胞中实现特异性表达并释放活性片段，从而达到对肿瘤进行精准治疗的目的，此外还提供了一种转录因子调控的纳米平台，h-cnp@pgmd纳米平台能够实现仿生gsdmd的充分表达和肿瘤特异性细胞焦亡，从而增强癌症免疫治疗的效果。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种表达仿生gsdmd蛋白的重组质粒，所述重组质粒含有sox4转录因子结合启动序列。

4、本发明首次构建了sox4转录因子调控的表达焦亡蛋白的质粒，通过基因工程的手段构建gsdmd基因的特异性表达重组质粒，使其在小鼠结直肠癌细胞中实现特异性表达并释放活性片段，从而达到对肿瘤进行精准治疗的目的，此外还提供了一种转录因子调控的纳米平台，h-cnp@pgmd纳米平台能够实现仿生gsdmd的充分表达和肿瘤特异性细胞焦亡，对正常细胞无损伤，能够增强癌症免疫治疗的效果。

5、优选地，所述重组质粒还含有gsdmd-n和gsdmd-c的基础碱基序列。

6、优选地，所述gsdmd-n和gsdmd-c通过mmp2响应肽段相连接。

7、优选地，所述重组质粒的核酸序列如seq id no:1所示。

8、seq id no:1：

9、acatgtggatccgaacaattgcagtgttgggtaagaacaattgcagtgttgggtaagaacaattgcagtgttgggtaagaacaattgcagtgttgggtaagaacaattgcagtgttgggtaagaacaattgcagtgttgggtaagagggtatataatgatgccatcggcctttgagaaagtggtcaagaatgtgatcaaggaggtaagcggcagcagaggcgatctcattccggtggacagcctgcggaactccaccagcttcaggccctactgccttctgaacaggaaattttcaagctcaaggttctggaaaccccgttattcatgtgtcaacctgtcaatcaaggacatcctggagcccagtgctccagaaccagaaccggagtgttttggctccttcaaagtctctgatgtcgtcgatgggaacattcagggcagagtgatgttgtcaggcatgggagaagggaaaatttctggtggggctgcagtgtctgacagttccagtgcctccatgaatgtgtgtatactgcgtgtgactcagaagacctgggagaccatgcagcatgaaaggcaccttcagcagcctgagaacaaaatcctgcaacagcttcggagtcgtggggatgacctgtttgtggtgaccgaggtgctgcagacaaaggaggaagtgcagatcactgaggtccacagccaagagggctcaggccagtttacgctgcctggagctttatgcttgaagggtgaaggcaagggccaccaaagccggaagaagatggtgaccattcctgcaggcagcatcctggcattccgagtggcccaactgcttattggctctaaatgggatatccttctcgtctcagatgagaaacagaggacctttgagccctcctcaggtgacagaaaagcagtgggccagaggcaccatggcctcaatgtgcttgctgcgctttgttccatcggaaagcagctcagtctcccactgggcctggccggcgaggaggaattaattgaggcggcagacttccagggcctgtatgctgaggtgaaggcttgctcctcagaactggagagcttggaaatggagttgagacaacagatactggtgaacatcggaaagattttacaggaccagcccagcatggaagccttagaggcctcactagggcagggcctgtgcag tggcggccaggtggagcctctggacggccc agctggctgcatccttgagtgtctggtgcttgactctggagaactggtgccggaactcgcagcccctatcttctacctgctgggagcactggctgtgctgagtgaaacccagcagcagctgctagctaaggctctggagacaacggtgctgtcaaagcagctggagttggtgaagcacgtcttggaacagagcaccccgtggcaggagcagagttctgtgtccctgcccaccgtgctccttggggactgctgggatgaaaagaatcccacctgggtcttgctagaagaatgtggcctaag gctgcaggta gaatcccccc aggtgcactg ggaaccaacgtctctgatccccacaagtgcgctctatgcctccctgttcctattgtcaagtctaggccagaaaccttgtgattacaaggatgacgacgataaggactataaggacgatgatgacaaggactacaaagatgatgacgataaatagggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctgcggccgcgactctagatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctcc ccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaa ttgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttaaggcgtaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaa taggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtcctgaggcggaaagaaccagctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaagatcgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacag acaatcggct gctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagcacgtactcgg atggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgatt cgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccctagggggaggctaactgaaacacggaaggagacaataccggaaggaacccgcgctatgacggcaataaaaagacagaataaaacgcacggtgttgggtcgtttgttcataaacgcggggttcggtcccagggctggcactctgtcgataccccaccgagaccccattggggccaatacgcccgcgtttcttccttttccccaccccaccccccaagttcgggtgaaggcccagggctcgcagccaacgtcggggcggcaggccctgccatagcctcaggttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatgg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10、第二方面，本发明提供了一种h-cnp@pgmd纳米载体，所述h-cnp@pgmd纳米载体含有第一方面所述的重组质粒。

11、优选地，所述h-cnp@pgmd纳米载体还含有介孔碳酸钙。

12、可以理解，基因工程领域通用的纳米材料均适用于本发明，不作特殊限制。

13、第三方面，本发明提供了一种第二方面所述的h-cnp@pgmd纳米载体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

14、(1)制备碳酸钙纳米载体，将含有cacl2的无水乙醇进行超声，超声后将含有所述无水乙醇的容器和含有nh4hco3的容器置于真空干燥器进行反应，离心，即得cnp；

15、(2)称取cnp超声分散于aptes中，加入氨水，置于磁力搅拌器上搅拌，离心得到cnp-nh2；

16、(3)将cnp-nh2和第一方面的重组质粒加入pbs中超声搅拌，离心，获得cnp@pgmd；

17、(4)将ha、pbs、edc和nhs的混合溶液置于a管于磁力搅拌器上搅拌，将cnp@pgmd与pbs的混合溶液置于b管充分分散，分散后将a管和b管中的溶液均质24h，离心即得h-cnp@pgmd。

18、其中，cnp为介孔碳酸钙纳米颗粒；aptes为3-氨基丙基三乙氧基硅烷；ha为透明质酸。

19、优选地，步骤(1)中所述制备碳酸钙纳米载体的方法包括气体扩散法。

20、优选地，步骤(1)中所述反应的时间为12-48h。

21、上述12-48h中的具体点值可以选择12h、16h、18h、20h、24h、28h、30h、34h、36h、38h、40h等。

22、优选地，步骤(2)中所述搅拌的时间为1-4h。

23、上述1-4h中的具体点值可以选择1h、2h、3h、4h等。

24、优选地，步骤(3)中所述搅拌的时间为1-4h。

25、上述1-4h中的具体点值可以选择1h、2h、3h、4h等。

26、优选地，步骤(4)中所述ha、pbs、edc和nhs的体积比为2:1:(35-40):(20-30)。

27、上述(35-40)中的具体点值可以选择35、36、37、38、39、40等。

28、上述(20-30)中的具体点值可以选择20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等。

29、优选地，步骤(4)中所述搅拌的时间为15-60min。

30、上述15-60min中的具体点值可以选择15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、58min、60min等。

31、优选地，步骤(4)中所述分散的时间为15-60min。

32、上述15-60min中的具体点值可以选择15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、58min、60min等。

33、优选地，步骤(4)中所述均质的时间为12-36h。

34、上述12-36h中的具体点值可以选择12h、16h、18h、20h、24h、28h、30h、34h、36h等。

35、第四方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物中含有第二方面所述的纳米载体。

36、第五方面，本发明提供了第一方面所述的重组质粒或第二方面所述的纳米载体在制备治疗癌症的药物中的应用；所述癌症包括结肠癌。

37、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

38、本发明首次构建了sox4转录因子调控的表达焦亡蛋白的质粒，通过基因工程的手段构建gsdmd基因的特异性表达重组质粒，使其在小鼠结直肠癌细胞中实现特异性表达并释放活性片段，从而达到对肿瘤进行精准治疗的目的，此外还提供了一种转录因子调控的纳米平台，h-cnp@pgmd纳米平台能够实现仿生gsdmd的充分表达和肿瘤特异性细胞焦亡，对正常细胞无损伤，能够增强癌症免疫治疗的效果。