一种抗CD63单域抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种抗cd63单域抗体及其应用。

背景技术：

1、外泌体是由多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外的直径在30-150nm的细胞外囊泡，其天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳等。自外泌体被发现的50年间，其被报道参与了各种生理病理功能的细胞间通讯，是目前生物医药研究的热点之一，也是未来极具前景的细胞疗法和精准医疗的“潜力新秀”。当前，外泌体在多种疾病的诊断和治疗中被证明具有良好的应用前景，例如，血液循环中的外泌体携带的microrna可用于心血管疾病的诊断、预后甚至治疗；中枢神经系统衍生的外泌体能够穿过血脑屏障并在细胞之间携带生物分子，可用于神经退行性疾病的早期诊断；在人类免疫缺陷病毒(hiv)中，外泌体也作为潜在生物标志物的载体，并显示出潜在的药物递送途径。

2、外泌体的鉴定工作是其广泛应用的必要基础，确保外泌体的质量对于充分发挥其作为疾病生物标志物和治疗剂的潜力至关重要。根据国际细胞外囊泡学会(internationalsociety for extracellularvesicles，isev)在2014年的提议及2018年的补充建议，对于分离获得的外泌体需要从大小、形态、表面标志物三个层面进行鉴定，其中表面标志物的鉴定需要三个外泌体特异性表达蛋白和一个外泌体阴性的指标综合判断所提取到的外泌体蛋白特异性。按misev2018建议，在外泌体特异性表达的蛋白中，为了证明分析材料中存在脂质双层，必须显示至少一种跨膜或糖基磷脂酰肌醇锚蛋白；为了证明所分析的材料包含的不仅仅是开放细胞片段，必须显示至少一种具有脂质或膜蛋白结合能力的胞质/周质蛋白。

3、cd63也被称为溶酶体相关膜蛋白3(lamp3)，属于四次跨膜蛋白超家族成员，是外泌体特异性标志蛋白。在结构上，cd63由四个跨膜结构域、一个细胞内末端和两个细胞外环组成。在功能上，cd63参与多种细胞进程，与细胞的活化、黏附、变异及肿瘤的侵袭、转移等有关。此外，cd63在晚期内体和多泡体的细胞蛋白分选中发挥关键作用，促进外泌体形成。在应用方面，以cd63蛋白为靶点开发多种适配体为介导外泌体药物的精准递送提供了契机。此外，研究证明cd63外泌体在卵巢癌和肺癌等特定癌症中差异表达，表明其作为诊断生物标志物的潜在用途。鉴于以上，cd63靶点的多面性为治疗、诊断和生物医学研究带来新希望。

4、当前外泌体表面标志物最常用的鉴定方法包括westernblot、elisa，这些方法均采用抗原抗体特异性结合的原理。换而言之，抗体识别的特异性和灵敏度是外泌体表面标志物鉴定质量的关键要素。然而，目前市场上开发的抗cd63抗体多是鼠源/兔源抗体，抗体特异性差、灵敏度低，使用过程中易出现“假阳性”和“假阴性”，这使得外泌体的分离和鉴定难度增加。此外，cd63抗体及其功能域在外泌体研究、诊断和治疗中也起着关键作用。高特异性和高灵敏度抗体的开发是外泌体行业的普遍且十分迫切的需求。

5、单域抗体(single-domain antibody，sdab)，也称为纳米抗体(nanobody，nb)，是一种天然存在的仅含有重链而完全缺乏轻链的抗体类型，主要来源于骆驼类，如单峰驼、亚州双峰驼、南美洲大羊驼、原驼、羊驼等，在普通双峰骆驼血液抗体中的占比高达50％–80％。对于典型的抗体，抗原结合由其重链(vh)和轻链(vl/vk)的可变结构域共同决定，而这种非常规的重链抗体(heavy chain antibody，hcab)，仅基于其重链的可变结构域vhh结构域与抗原结合。与传统的抗体相比，单域抗体具有其独特的理化特性。具体表现在：1)运输能力强。由于无轻链，单域抗体的分子量较小(约15kda)因此很容易将靶向药物运载到细胞内，甚至能穿过血脑屏障。2)溶解度和稳定性好。常规抗体的骨架2区具有多个疏水作用的保守氨基酸，而单域抗体的骨架2区经过进化后疏水氨基酸被亲水氨基酸取代，因此单域抗体具备了更好的可逆折叠能力和抗蛋白质降解能力。此外，单域抗体的变性温度往往可以达到60℃～80℃，一些单域抗体对2.3～3.3摩尔/升的盐酸胍有较好的耐受性。同时，单域抗体中额外的二硫键增强了vhh构象结构的稳定性，使其不被胃蛋白酶和糜蛋白酶降解，因此一些单域抗体可作为口服药物。3)抗原识别更灵敏。单域抗体的长互补决定区(complementarity-determining region，cdr)较长，使其与抗原的结合方式更加灵活，暴露出的凸形互补位可以进入传统抗体难以接近的抗原表面空洞或裂缝，由此抗原可以很容易地被nb的长互补决定区cdr3识别。4)免疫原性小。传统的鼠单克隆抗体与人源抗体的差异较大，免疫原性强，通常都要进行一个复杂的人源化过程才能进行更进一步的应用，而骆驼抗体的vh和人抗体的vh相似度高，骆驼单域抗体的免疫原性更小，因而更易于进行人源化改造和临床应用。鉴于以上优势，cd63单域抗体的研究和开发在外泌体鉴定、诊断和治疗等方面都具有十分广阔的前景。

技术实现思路

1、本发明的目的在于设计出一种抗cd63单域抗体及其应用，本发明通过免疫羊驼，采用噬菌体表面展示技术筛选获得具有高亲和力的anti-cd63纳米抗体，在外泌体研究中具有巨大的意义。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种抗cd63单域抗体，其互补决定区cdr包括cdr1、cdr2和cdr3，其中,所述的cdr1序列如seq id no:2所示，所述的cdr2序列如seq id no:4所示，所述的cdr3序列如seq idno:6所示。

4、序列表

5、 seq id no:2 cdr1 gfpldlwt seq id no:4 cdr2 ingrngrfd seq id no:6 cdr3 vadrwysvleptydy

6、所述的互补决定区cdr被四个框架区fr1、fr2、fr3和fr4所分隔，其中，seq id no:1所示的fr1，seq id no:3所示的fr2，seq id no:5所示的fr3，seq id no:7所示的fr4。

7、序列表

8、 seq id no:1 fr1 qvqlvesggglvqpgnsltlscvts seq id no:3 fr2 vgwfrqvpgkeregvsv seq id no:5 fr3 iadsvkgrftisidkakntvylrmnnlnaddsgvyyc seq id no:7 fr4 wgqgtqvtvss

9、所述抗cd63单域抗体是特异性结合cd63的抗体，具有seq id no:8所示氨基酸序列。

10、序列表

11、

12、其序列中有至少80％的氨基酸序列与seq id no:8所示氨基酸序列相同或形似。

13、本发明还提供一种抗cd63单域抗体的融合蛋白，其包含权利要求1所述的抗cd63单域抗体以及免疫球蛋白fc区，所述免疫球蛋白fc区是人免疫球蛋白fc区。

14、本发明还提供一种核酸，编码权利要求1所述抗cd63单域抗体的核酸。

15、本发明还提供一种表达载体，其包含权利要求6所述的核酸。

16、本发明还提供一种宿主细胞，其包含有权利要求7所述的表达载体。

17、本发明还提供了所述单域抗体和所述生物材料的下述任一种应用：

18、(1)在制备用于外泌体鉴定、分离或纯化的产品中的应用，或在外泌体鉴定、分离或纯化中的应用；

19、(2)在制备用于诊断或治疗疾病的产品中的应用，或在诊断或治疗疾病中的应用；

20、(3)在检测cd63蛋白或制备用于检测cd63蛋白的产品中的应用；

21、(4)在制备用于结合cd63蛋白的产品中的应用；

22、(5)在介导药物特异性识别表达cd63抗原或制备介导药物特异性识别表达cd63抗原的产品中的应用；

23、(6)在cd63蛋白的体内成像或制备用于cd63蛋白的体内成像的产品中的应用。

24、进一步的所述应用，其特征在于：抗cd63单域抗体是结合cd63表位的且可以阻断与cd63相互作用的抗体。

25、本发明还提出一种抗cd63单域抗体单域抗体的应用，抗cd63单域抗体是结合cd63表位的且可以阻断与cd63相互作用的抗体。

26、本发明首先利用cd63重组蛋白免疫羊驼得到单域抗体基因并构建单域抗体表达文库，然后通过噬菌体展示筛选技术从单域抗体表达文库中筛选得到高亲和力的抗cd63单域抗体。测序得到抗体基因序列后，采用基因工程的方法制备anti-cd63单域抗体，进一步对获得的抗体进行了亲和力性能实验。实验结果证明，本发明通过免疫羊驼和筛选所获得的anti-cd63纳米抗体与人cd63-his蛋白亲和的半数最大效应浓度(half-maximaleffective concentration，ec50)仅为0.696nm，具有较高的与cd63蛋白亲和的能力。

27、通过上述技术方案可以得到以下有益效果：

28、(1)本发明得到的单域抗体，表达体系选择灵活，既可以在原核系统中表达也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞的真核系统中表达，且其在原核表达系统中的表达成本低，可以降低后期生产成本。

29、(2)本发明得到的单域抗体，其抗体的多组合形式改造简单，通过基因工程的方式简单的串联即可获得多价、多特异性的抗体，并且其免疫异质性很低，在不经过人源化改造的情况下也不会产生较强的免疫反应。

30、(3)本发明得到的单域抗体亲和力高，可用于后期不同用途。

31、(4)本发明得到的单域抗体可单独使用或作为外泌体载药系统携带相关药物，在外泌体药物应用和临床诊断等领域具有十分广阔的前景和巨大的意义。