一种黑色素瘤分子分型及生存风险基因群、诊断产品及其应用的制作方法

本发明涉及c12q，更具体地，本发明涉及一种黑色素瘤分子分型及生存风险基因群、诊断产品及其应用。

背景技术：

1、黑色素瘤作为黑色素细胞来源的肿瘤，具有高的恶性程度，占皮肤恶性肿瘤的第三位，且目前的黑色素瘤的病因尚未完全清楚且有多种诱因，使得发病率增长迅速的同时，难以有效治疗和评估。目前随着个体化靶向治疗和免疫治疗的研究增加，促进黑色素瘤的临床治疗，也使得晚期黑色素瘤的1年生存率从上世纪90年代的25％-35％延长到了如今的75％。

2、而在这之中，基于braf靶基因的识别、基于表达谱的风险评估等的分子诊断技术对黑色素瘤的诊治水平的提高起到了重要作用。其中基于表达谱的肿瘤分子分型促进将不同内在生物学特征，如增殖、免疫以及预后状态的肿瘤分成不同亚型，来针对性考察不同亚型对于治疗的应答率。

3、如美国castle biosciences公司开发了一种基于31基因表达的黑色素瘤风险评估产品decisiondx-melanoma，将i-iii期黑色素瘤的复发或转移风险分为低和高两组，用于指导临床随访及前哨淋巴结活检。但目前还未建立完善的黑色素瘤分型及风险评估模块，难以对各种亚型的黑色素瘤提供准确、便捷的分析方法。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本项目通过检测黑色素瘤组织当中的相关功能基因表达水平，对恶性皮肤黑色素瘤进行分子分型以及生存风险评估，进而对我国黑色素瘤的临床治疗提供指导。

2、本发明第一方面提供了一种黑色素瘤分子分型及生存风险基因群，包括：

3、增殖相关基因：anln、cenpf、clspn、top2a、ccnb1、cdca8、mki67；

4、细胞外基质相关基因：adamts2、col1a1、col5a1、col6a3；

5、免疫相关基因：cd8a、il2rg、itgal、slamf6、apobec3g、hla-dpb1、samhd1；

6、炎症反应相关基因：s100a8、s100a9、tacstd2；

7、作为本发明一种优选的技术方案，所述增殖相关基因中anln、cenpf、clspn、top2a参与分型；所述增殖相关基因中ccnb1、cdca8、mki67参与计算增殖指数。

8、作为本发明一种优选的技术方案，所述免疫相关基因中cd8a、il2rg、itgal、slamf6参与分型；所述免疫相关基因中apobec3g、hla-dpb1、samhd1参与计算免疫指数。

9、作为本发明一种优选的技术方案，所述的黑色素瘤分子分型及生存风险基因群的参考基因还包括gapdh、gusb、actb。

10、进一步地，本发明提供了一种24基因的黑色素瘤分子分型及生存风险基因群，具体包括：

11、增殖相关基因(7个)：anln、cenpf、clspn、top2a、ccnb1、cdca8、mki67。

12、细胞外基质相关基因(4个)：adamts2、col1a1、col5a1、col6a3。

13、免疫相关基因(7个)：cd8a、il2rg、itgal、slamf6、apobec3g、hla-dpb1、samhd1。

14、炎症反应相关基因(3个)：s100a8、s100a9、tacstd2。

15、参考基因(3个)：actb、gapdh、gusb。

16、所述增殖相关基因中anln、cenpf、clspn、top2a参与分型；所述增殖相关基因中ccnb1、cdca8、mki67参与计算增殖指数。

17、所述免疫相关基因中cd8a、il2rg、itgal、slamf6参与分型；

18、所述免疫相关基因中apobec3g、hla-dpb1、samhd1参与计算免疫指数。

19、作为本发明一种优选的技术方案，所述增殖相关基因还包括cep55、dlgap5、kif11、kif14、mcm10、ncapg、ncaph、ndc80、nek2、stil、ttk、cdc6、cenpa、kif2c、kif4a、spag5、tpx2；其中anln、cenpf、clspn、top2a、cep55、dlgap5、kif11、kif14、mcm10、ncapg、ncaph、ndc80、nek2、stil、ttk参与分型；所述ccnb1、cdca8、mki67、cdc6、cenpa、kif2c、kif4a、spag5、tpx2参与计算增殖指数。

20、作为本发明一种优选的技术方案，所述细胞外基质相关基因还包括adamts12、cd248、col1a2、col4a1、col5a2、col6a2、crispld2、dcn、ltbp2、nid2、olfml2b、podn。

21、作为本发明一种优选的技术方案，所述免疫相关基因还包括apbb1ip、ccr5、cd247、cd4、cd86、coro1a、inpp5d、itgb2、lck、nckap1l、ptpn6、sash3、sla2、ubash3a、vav1、was、cd40、gbp2、il15、il18bp、irf1、trim22；其中cd8a、il2rg、itgal、slamf6、apbb1ip、ccr5、cd247、cd4、cd86、coro1a、inpp5d、itgb2、lck、nckap1l、ptpn6、sash3、sla2、ubash3a、vav1、was参与分型；所述apobec3g、hla-dpb1、samhd1、cd40、gbp2、il15、il18bp、irf1、trim22参与计算免疫指数。

22、作为本发明一种优选的技术方案，所述黑色素瘤分子分型及生存风险基因群的参考基因还包括gapdh、gusb、mrpl19、psmc4、sf3a1、tfrc。

23、进一步地，本发明提供了一种78基因的黑色素瘤分子分型及生存风险基因群，具体包括：

24、增殖相关基因(24个)：anln、cenpf、clspn、top2a、ccnb1、cdca8、mki67、cep55、dlgap5、kif11、kif14、mcm10、ncapg、ncaph、ndc80、nek2、stil、ttk、cdc6、cenpa、kif2c、kif4a、spag5、tpx2；其中anln、cenpf、clspn、top2a、cep55、dlgap5、kif11、kif14、mcm10、ncapg、ncaph、ndc80、nek2、stil、ttk参与分型；所述ccnb1、cdca8、mki67、cdc6、cenpa、kif2c、kif4a、spag5、tpx2参与计算增殖指数。

25、细胞外基质相关基因(16个)：adamts2、col1a1、col5a1、col6a3、adamts12、cd248、col1a2、col4a1、col5a2、col6a2、crispld2、dcn、ltbp2、nid2、olfml2b、podn

26、免疫相关基因(29个)：cd8a、il2rg、itgal、slamf6、apobec3g、hla-dpb1、samhd1、apbb1ip、ccr5、cd247、cd4、cd86、coro1a、inpp5d、itgb2、lck、nckap1l、ptpn6、sash3、sla2、ubash3a、vav1、was、cd40、gbp2、il15、il18bp、irf1、trim22；其中cd8a、il2rg、itgal、slamf6、apbb1ip、ccr5、cd247、cd4、cd86、coro1a、inpp5d、itgb2、lck、nckap1l、ptpn6、sash3、sla2、ubash3a、vav1、was参与分型；所述apobec3g、hla-dpb1、samhd1、cd40、gbp2、il15、il18bp、irf1、trim22参与计算免疫指数。

27、炎症反应相关基因(3个)：s100a8、s100a9、tacstd2。

28、参考基因(6个)：gapdh、gusb、mrpl19、psmc4、sf3a1、tfrc。

29、本发明第二方面提供了一种黑色素瘤分子分型诊断产品，所述黑色素瘤分子分型诊断产品包括黑色素瘤分子分型及生存风险基因群；如试剂盒；用于检测skcm1、skcm2、skcm3、skcm4、skcm5分型。

30、作为本发明一种优选的技术方案，所述黑色素瘤的亚型包括skcm1型黑色素瘤、skcm2型黑色素瘤、skcm3型黑色素瘤、skcm4型黑色素瘤、skcm5型黑色素瘤；其中，skcm1、skcm2、skcm3、skcm4、skcm5分别表示该样本与skcm1、skcm2、skcm3、skcm4、skcm5的pearson相关系数。

31、所述skcm1型黑色素瘤的分型用增殖相关基因低表达，分型用细胞外基质相关基因中等表达，分型用免疫相关基因高表达，10年总生存率较好；

32、所述skcm2型黑色素瘤的分型用增殖相关基因高表达，分型用细胞外基质相关基因中等表达，分型用免疫相关基因低表达，10年总生存率较差；

33、所述skcm3型黑色素瘤的分型用增殖相关基因中等表达，分型用细胞外基质相关基因低表达，分型用免疫相关基因高表达，10年总生存率最好；

34、所述skcm4型黑色素瘤的分型用增殖相关基因中等表达，分型用细胞外基质相关基因高表达，分型用免疫相关基因低表达，10年总生存率较差；

35、所述skcm5型黑色素瘤的分型用增殖相关基因中等表达，分型用细胞外基质相关基因中等表达，分型用免疫相关基因低表达，10年总生存率最差。

36、本发明第三方面提供了一种黑色素瘤分子分型诊断产品的应用，包括：

37、样品的检测：测试样品中黑色素瘤分子分型及生存风险基因群的表达谱，得到表达谱和x亚型黑色素瘤的相关系数rx，x亚型选自skcm1型黑色素瘤、skcm2型黑色素瘤、skcm3型黑色素瘤、skcm4型黑色素瘤或skcm5型黑色素瘤。

38、分子亚型判断：当rx最大值对应的x亚型的可信限大于等于0.8时，样本为x亚型。

39、作为本发明一种优选的技术方案，所述分子亚型模型建立：

40、进一步地，所述黑色素瘤分子分型诊断产品的应用，包括：

41、样品的检测：测试样品中黑色素瘤分子分型及生存风险基因群的表达谱，得到x亚型黑色素瘤的相关系数rx，所述生存风险评估用增殖相关基因可得到增殖指数pi、所述生存风险评估用免疫相关基因可得到免疫指数is；x亚型选自skcm1型黑色素瘤、skcm2型黑色素瘤、skcm3型黑色素瘤、skcm4型黑色素瘤或skcm5型黑色素瘤；

42、分子亚型判断：当rx最大值对应的x亚型的可信限大于等于0.8时，样本为x亚型。

43、生存风险评估分，所述计算生存风险评估分的公式如下：(0.1～0.25)×rskcm1+(-0.4～-0.2)×rskcm2+(-0.4～-0.1)×rskcm3+(-0.1～0.2)×rskcm4+(0.1～0.4)×rskcm5+(0.1～0.4)×pi+(-1～-0.4)×is。

44、作为本发明一种优选的技术方案，所述分子亚型模型建立：通过epig基因表达谱分析程序(参见zhou t,et al.,2006.environ health perspect 114(4),553-559；choujw,et al.,2007.bmc bioinformatics 8,427)分析tcga数据库中462例具有完整临床信息的黑色素癌基因表达量，获得本发明基因的表达谱。进一步地，根据基因的表达谱，采用层次聚类的方法，比较各检测基因间的相似性，将基因进行分组；比较黑色素瘤样本间表达谱的相似性，将黑色素癌进行分组，将其分为skcm1型、skcm2型、skcm3型、skcm4型、skcm5型；将黑色素瘤分子亚型的基因表达谱作为标准测试数据，用于对样本进行分子分型和生存风险评估。

45、作为本发明一种优选的技术方案，计算样本亚型：

46、(1)根据本发明的基因群在具有统计学显著性数量的黑色素瘤样本(训练集)中的表达数据，建立skcm1型、skcm2型、skcm3型、skcm4型、skcm5型中本发明基因群的表达谱作为标准测试数据；

47、(2)根据检测所述样本中本发明基因群中基因的表达水平，采用pearson相关分析法，计算所述样本中本发明基因群的表达谱与标准测试数据的skcm1型、skcm2型、skcm3型、skcm4型或skcm5型中基因表达谱之间的相关系数；

48、(3)当所述样本基因表达谱与x亚型(x选自skcm1型、skcm2型、skcm3型、skcm4型和skcm5型)中基因表达谱的相关系数最高且可信限大于等于0.8时，可将所述样本判断为x亚型。

49、作为本发明一种优选的技术方案，所述24基因的生存风险评估分计算公式如下：

50、生存风险评估分＝(0.23×rskcm1)+(-0.26×rskcm2)+(-0.34×rskcm3)+(0.12×rskcm4)+(0.26×rskcm5)+(0.39×pi)+(-0.42×is)。

51、作为本发明一种优选的技术方案，所述78基因的生存风险评估分计算公式如下：

52、生存风险评估分＝(0.15×rskcm1)+(-0.29×rskcm2)+(-0.20×rskcm3)+(-0.04×rskcm4)+(0.24×rskcm5)+(0.22×pi)+(-0.82×is)。

53、作为本发明一种优选的技术方案，所述生存风险评估用增殖相关基因可得到增殖指数，用于评估黑色素瘤的预后。

54、所述计算增殖指数：本发明的基因群中的增殖相关基因在具有统计学显著性数量的黑色素瘤样本(训练集)中的表达数据，计算训练集中增殖相关基因表达水平的加权平均值，结合生存数据，采用本领域已知的统计学软件(例如x-tile软件、spss或其他能够用于计算临界值的分析软件，优选x-tile软件)进行生存分析，取得能最大限度区分生存曲线差异的加权平均值作为临界值。增殖指数可以通过以下公式计算：

55、

56、其中n为用于计算免疫指数的免疫相关基因的个数。

57、作为本发明一种优选的技术方案，所述生存风险评估用免疫相关基因可得到免疫指数，用于评估黑色素瘤的预后。

58、所述计算免疫指数：本发明的基因群中的免疫相关基因在具有统计学显著性数量的黑色素瘤样本(训练集)中的表达数据，计算训练集中免疫相关基因表达水平的加权平均值，结合生存数据，采用本领域已知的统计学软件(例如x-tile软件、spss或其他能够用于计算临界值的分析软件，优选x-tile软件)进行生存分析，取得能最大限度区分生存曲线差异的加权平均值作为临界值。免疫指数可以通过以下公式计算：

59、

60、其中n为用于计算免疫指数的免疫相关基因的个数。

61、作为本发明一种优选的技术方案，所述24基因的生存风险评估采用荧光定量pcr方法进行测定，应用所述试剂盒通过单重rt-pcr检测来进行黑色素瘤分子分型和生存风险评估的方法包括：取黑色素瘤肿瘤组织，提取肿瘤细胞中的rna，采用taqman rt-pcr技术，使用所示引物和探针，分别检测基因的表达水平。具体步骤如下：

62、步骤1：取检测对象黑色素瘤肿瘤或石蜡包埋组织，利用检测试剂盒中的方法获取检测对象含肿瘤细胞高的区域为原始材料；

63、步骤2：提取组织中总rna。可以使用rna storm cd201rna或者qiagen rneaseffpe kit rna抽提试剂盒来提取；

64、步骤3：rt-pcr检测，所述rt-pcr检测的方法为taqman rt-pcr，将中所示基因分别进行rt-pcr检测；步骤如下：

65、(3-1)：提取检测对象的总rna；

66、(3-2)：对(3-1)所得rna进行反转录，具体步骤为：取总量为2μg左右的样本rna(例如取200ng/μl左右的样本rna 11μl)，和11μl参考rna一起反转录(thermo k1622反转录试剂盒)获得样本cdna和参考cdna；向样本cdna加入80μl无rna酶水将其5倍稀释，向参考cdna加入180μl无rna酶水将其10倍稀释；

67、(3-3)：对(3-2)所得对应每个基因的cdna样本进行taqman rt-pcr检测对21个黑色素瘤分子分型及生存风险相关基因和3个参考基因分别进行检测。步骤如下：(ⅰ)制备每孔反应体系：(3-2)所得的cdna样本2μl(总量100-400ng)，正向、反向特异性引物及taqman荧光探针(10μm)共1.4μl，反应预混合液10μl，depc水6.6μl；(ⅱ)95℃灭活逆转录酶2分钟；(ⅲ)扩增与检测：95℃变性25秒，60℃退火、延伸及荧光检测60秒，进行45个循环，暂缓期60℃60秒；扩增反应结束后，记录每个基因的ct值，代表了各个基因的表达水平；

68、步骤4：结果统计分析；将所得测序结果进行统计分析。然后对受试者的黑色素瘤进行分子分型，计算免疫指数、增殖指数和生存风险评分，并预测生存风险。

69、作为本发明一种优选的技术方案，所述78基因的生存风险评估采用二代测序方法，使用二代测序检测试剂盒确定黑色素瘤肿瘤分子分型和评估黑色素瘤患者的生存风险的方法，包括以下步骤：

70、步骤1：取检测对象黑色素瘤肿瘤或石蜡包埋组织，利用检测试剂盒中的方法获取检测对象含肿瘤细胞高的区域为原始材料；

71、步骤2：提取组织中总rna；可以使用rna storm cd201rna或者qiagen rneaseffpe kit rna抽提试剂盒来提取；

72、步骤3：将所得rna制成可供测序的文库；将所得组织的rna制成可供靶向rna-seq技术二代测序的文库，文库的制备方法包括以下步骤：

73、(3-1)：使用ⅱ逆转录酶(new england biolabs，#m0368l)将步骤(2)中提取的rna反转录成cdna；

74、(3-2)：使用illumina的targeted rna建库试剂盒(#15034457)将所得cdna处理制成可供测序的文库，具体步骤如下：(ⅰ)杂交：加入top4.5μ1，混匀后加入21μ1ob1，升温至70℃后缓慢梯度降温至30℃；(ⅱ)延伸和连接：将(ⅰ)中产物用磁力架吸附后弃上清，用试剂盒中am1和ub1洗涤两次后弃上清，加入36μl elm4，在pcr仪或金属浴中37℃孵育45分钟；(ⅲ)对(ⅱ)所得产物进行测序标签(index)的连接，然后pcr：将(ⅱ)所得产物用磁力架吸附后弃上清，加入稀释40倍的hp3 18μ1，用磁力架吸附后吸取16μ1，加入17.3μ1tdp1、0.3μ1pmm2、6.4μ1index,混匀后进行pcr扩增32个循环；(ⅳ)釆用gnome dna(questgenomics，南京)纯化试剂盒纯化dna，得到文库；

75、步骤4：对所得dna文库进行用nextseq/miseq/miniseq/iseq进行二代测序；用illumina nextseq/miseq/miniseq/iseq测序仪进行双端测序或单端测序；此过程均由仪器本身自动完成(illumina公司)；

76、步骤5：结果统计分析；将所得测序结果进行统计分析。然后对受试者的黑色素瘤进行分子分型，计算免疫指数、增殖指数和生存风险评分，并预测生存风险。

77、本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

78、本发明提供两种黑色素瘤分子分型及生存风险基因群、诊断产品及其应用，通过检测黑色素瘤组织当中的相关功能基因表达水平，并对相关基因按照功能不同进行分类，可分别用于恶性皮肤黑色素瘤的分子分型以及生存风险评估，从而根据不同黑色素瘤的基因表达建立skcm1、skcm2、skcm3、skcm4、skcm5五种亚型模型，并对不同亚型的10年生存率进行统计，可快速、准确的建立相关黑色素瘤模型，适用不同场合的黑色素瘤分型和/或风险检测。且本发明提供的基因群用于黑色素瘤相关产品时，具有高的可靠性和可重复性。

79、本发明提供的生存风险评估用增殖相关基因可得到增殖指数，可以用于评估黑色素瘤的预后。

80、本发明提供的生存风险评估用增殖相关基因可得到免疫指数，可以用于评估黑色素瘤的预后。