一株促进盐碱土壤田菁生长和结瘤的剑菌及其应用

本发明属于农业微生物应用，具体涉及一株促进盐碱土壤田菁生长和结瘤的剑菌ensifer sp.ksu03及其制备的剑菌微生物菌剂和应用的。

背景技术：

1、土壤盐碱化是典型的非生物胁迫因素之一，严重影响土壤养分运转和分布，使植物正常的生殖生理过程受到抑制。土壤盐碱化导致大部分作物不能正常生产，成为限制农业生态系统稳定性和可持续发展的主要因素。我国盐碱土地面积大，分布广，尤其近半个世纪以来伴随人口数量激增、气候变化和农业水肥管理不当等因素，土壤盐碱化和次生盐渍化趋势日益加重，大面积的农耕土地呈退化态势。修复盐碱地使之成为后备耕地资源，具有重要的经济和社会意义。研究发现，采用生物接种法，即接种对植物有益的菌群，能有效缓解盐碱胁迫对植物的不利影响，对促进其在盐碱土中生长及土壤性质改良有积极作用。基于土壤有益菌移植改良盐碱地是顺应科技发展的一种低影响、高效益的方式。

2、剑菌属(ensifer)是根瘤菌科(rhizobiaceae)的一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性杆菌，与中华根瘤菌属sinorhizobium为同物异名。豆科植物与根瘤菌的共生固氮体系一直是关注热点，这种共生体系能够改善因污染和退化而导致的土壤结构变差以及土壤养分不足等问题。利用外源接种ensifer菌株促进豆科植物结瘤固氮，不仅可促进植物生长，还可以改善和补充贫瘠土壤中的氮营养，有望为盐碱地改良探索出一条新路。

3、田菁(sesbania cannabina)为豆科田菁属一年生草本盐生植物，在盐碱、贫瘠等胁迫环境下具有较强的抗逆性。田菁根系发达，根瘤多而大，固氮能力强，鲜草产量高，养分含量丰富，这些特点使得其成为盐碱地土壤改良和改造的先锋植物。而根瘤菌可侵入田菁体内并形成根瘤，与其建立共生固氮体系，促进田菁生长的同时还能补充土壤氮素养分。因此，接种高效根瘤菌是促进田菁共生固氮，改善其营养状况的有效策略。目前对于田菁根瘤菌的研究已有少量报道：如发明专利cn110063161a公开了一种利用田菁茎瘤固氮根瘤菌促进穿心莲生长并提高其有效成分含量的方法；发明专利cn113179882a公开了一种利用田菁固氮根瘤菌促进茎瘤芥根系结瘤固氮的方法。但是，现有的类似菌剂产品没有广泛的盐碱适应性，无法针对干旱半干旱区盐碱地区推广应用。因此，有必要针对干旱半干旱区盐碱地开发促进田菁结瘤和生长的微生物菌剂产品，以促进其作为“绿肥”在盐碱地改良肥土中的应用。

技术实现思路

1、针对现有技术未见有干旱半干旱区盐碱地促进田菁结瘤和生长的微生物菌剂，亟需开发高效的促进盐碱土壤田菁生长和结瘤的微生物菌种，以促进其作为“绿肥”在盐碱地改良肥土中的应用的技术现状，本发明旨在于一株促进盐碱土壤田菁生长和结瘤的剑菌ensifer sp.ksu03及其制备的剑菌微生物菌剂和应用，本发明从新疆喀什市盐碱地田菁试种区田菁根瘤中分离得到了一株剑菌ensifer sp.ksu03。该菌株ksu03耐盐碱，能够溶解无/有机磷、具有分泌植物生长激素(indole-3-acetic acid,iaa)、合成1-氨基环丙烷-1-羧酸(acc)脱氨酶、产生胞外多糖的特性。采用ensifer sp.ksu03及其制备的剑菌微生物菌剂处理田菁，能有效促进田菁结根瘤，结根瘤数量达到15.07个；田菁株高、茎粗和地上干重均显著提高；田菁单株固氮量、叶片叶绿素含量也有显著改善，检测土壤含盐量全盐相比原始土壤和对照组分别下降了36.05％和20.2％，表明本发明ensifer sp.ksu03及其制备的剑菌微生物菌剂在盐碱地田菁促生方面具有广阔的开发和应用前景，不仅可以减少化肥用量，还可以促进田菁生长。

2、为了达到以上技术效果，本发明通过如下技术方案实现。

3、本发明提供一株促进盐碱土壤田菁生长和结瘤的剑菌ensifer sp.ksu03，所述菌株ensifer sp.ksu03保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctcc no：m2023823。

4、本发明提供的剑菌ensifer sp.ksu03是从新疆喀什市盐碱地田菁试种区田菁根瘤中筛选分离，经16sr rna序列系统发育分析和形态学分析，菌株ksu03属于ensifer属。通过对该菌株基因测序，所得序列在ncbi网站进行blast比对分析，菌株ksu03的16sr rna基因序列与标准菌株ensifer sesbaniae ccbau 65729t(genbank no:jf834143)的同源性最高，相似度为98.69％。选取同源性高的序列构建16sr rna系统发育树，菌株ksu03与ensifer morelensis lc04t(ay024335)菌株聚为一枝，亲缘关系最近。经过系列多相分类鉴定可确定该菌株ksu03为ensifer属新菌种，具有新菌种典型性的特点。

5、上述剑菌ensifer sp.ksu03的基因序列如seq id no:1所示。

6、本发明中，所述剑菌ensifer sp.ksu03的分离培养基为：甘露醇10.0g/l、酵母粉1g/l，mgso4·7h2o 0.2g/l，k2hpo4·3h2o 0.5g/l，fecl3·3h2o 0.004g/l，nacl 0.1g/l，0.25％刚果红溶液10ml/l，琼脂20g/l。

7、本发明中，所述剑菌ensifer sp.ksu03的纯化培养基为：甘露醇10.0g/l、酵母粉1g/l，mgso4·7h2o 0.2g/l，k2hpo4·3h2o 0.5g/l，fecl3·3h2o 0.004g/l，nacl 0.1g/l。

8、本发明提供一种ensifer sp.ksu03剑菌微生物菌剂，该微生物菌剂由剑菌ensifer sp.ksu03经发酵制备获得。

9、同时，本发明提供一种ensifer sp.ksu03剑菌微生物菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：将剑菌ensifer sp.ksu03的单菌落接种到yma培养基中，于28℃、180rpm的条件下培养48h，得到ensifer sp.ksu03种子液；将ensifer sp.ksu03种子液，按照体积比为2％的接种量接入专用液体培养基，于28℃、180rpm发酵培养48h，调整od600为0.8，获得ensifersp.ksu03剑菌微生物菌剂。

10、上述专用液体培养基为：蔗糖7.5g/l、酵母粉1.5g/l，mgso4·7h2o 0.2g/l，k2hpo4·3h2o 0.5g/l，fecl3·3h2o 0.004g/l，nacl 0.1g/l，初始ph值8，装液量40％。

11、本发明提供一种剑菌ensifer sp.ksu03在盐碱地田菁生长和结瘤中的应用，可促进田菁生长，在植物促生方面具有广阔的开发和应用前景。

12、本发明提供一种ensifer sp.ksu03剑菌微生物菌剂在盐碱地田菁生长和结瘤中的应用，可促进田菁生长，在植物促生方面具有广阔的开发和应用前景。

13、通过以上技术方案，本发明得到以下技术效果：

14、(1)本发明提供一株剑菌ensifer sp.ksu03，经过本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定，结合根据形态学鉴定、生理生化特征等多相分类系统鉴定分析，菌株ksu03与该属同源性最近的标准模式菌株存在多项不同，确为是ensifer sp.新菌种，证实获得剑菌范畴内菌种编号为ksu03属于一种典型的新菌种，进而有必要进行按照法律要求的保藏。

15、(2)本发明提供一种ensifer sp.ksu03经发酵获得剑菌微生物菌剂，浸泡田菁种子和幼苗接种微生物菌剂，田菁株高、茎粗和地上干重较对照增加了29.5％、24.1％和56.6％；田菁单株固氮量可达5.56±1.98mmol c2h4/(株·h)，显著高于对照组，田菁叶片叶绿素含量较对照增加了33.6％，表明其可有效促进田菁生长及生物量积累。

16、(3)采用本发明ensifer sp.ksu03剑菌微生物菌剂浸泡田菁种子和接种幼苗，田菁结根瘤平均达到15.07个，对照则没有形成根瘤，表明其能有效促进田菁结根瘤生长。

17、(4)采用本发明ensifer sp.ksu03剑菌微生物菌剂浸泡田菁种子和接种幼苗，考察土壤速效氮含量、全盐含量，结果发现，本发明提供的微生物菌剂处理田菁后，土壤速效氮含量较对照高52.8％，土壤全盐含量相比原始土壤下降了36.05％，表明本发明提供的新菌和新菌微生物菌剂能够减少盐碱地土壤盐分、增加土壤速效氮养分含量，应用前景广阔。