一种将Illumina文库快速转化为MGI测序平台文库的试剂及方法与流程

本技术涉及分子测序，特别是涉及一种将illumina文库快速转化为mgi测序平台文库的试剂及方法。

背景技术：

1、二代测序技术(next generation sequencing technology，ngs)因其同期可以实现数百万条dna分子测序，又被称之为高通量测序技术。目前主流的二代测序平台以美国因美纳(illumina)公司推出的各种通量的测序仪为代表。所以在依托ngs为基础蓬勃发展的体外诊断检测的发展中早期，产品的开发也主要针对illumina测序平台设计。特别是随着靶向产品的应用常规化，应对illumina测序仪高通量开发的多标签文库，在减少串扰的同时更丰富了应用。靶向产品检测主要分为湿实验和干实验两个部分，其中湿实验分为：连接illumina接头的预文库构建-靶向捕获文库构建-上机测序；干实验为illumina测序数据分析及报告输出。湿实验是前提，成败决定了干实验输出结果的真实可靠。

2、以华大智造为例，在二代测序仪方面持续发力，相继推出不同通量的测序仪，日产最高可达6t。其测序仪在价格、测序时长及测序质量方面也表现较好(比较突出的特点是单一原始模板滚环扩增，降低了错误积累；以及规则阵列芯片的高信号密度，可提高检测的准确性)，故有较多平台迁移的需求。相比于illumina测序平台，mgi测序平台在测序原理上存在一定的差异。反映到整个流程上，湿实验主要包括为：连接mgi接头的预文库构建-靶向捕获文库构建-环化-make dnb-上机测序【https://www.mgi-tech.com/products/】；干实验为mgi测序数据分析及报告输出。所以不同测序平台会针对性的设置不同的干湿实验产品使用及参数。

3、illumina测序仪登陆时间长、应用成熟化以及市场份额占比高。检测或应用型公司重新开发一整套应用于mgi测序平台的检测产品需要消耗较高的成本。华大智造应对市场转型问题，也抛出了解决方案，即完成illumina平台捕获文库后衔接一轮平台转化实验，此流程需要额外使用一整套转化试剂并延长约1h的实验时长。该转换现有的缺陷和不足如下：

4、1)基于靶向捕获方法的ngs检测流程整体时间较长，转化平台需要多一步的转化实验。意味着增加了流程复杂性、试剂消耗及人员、时间成本。本技术立足此痛点，通过在文库构建环节即使文库引入磷酸化修饰，减去了转化这一步骤，可以达到约缩短1h的实验时长及相应的试剂人员成本。同时，此磷酸化文库依然可以进行illumina平台的测序，双测序平台互做备份。

5、2)mgi测序平台需要在上机前完成一轮环化。环化效率直接影响make dnb的有效性。华大智造的mgieasy通用文库转换试剂盒(app-a)，可以实现将双链状态的线性dna文库(例如，illumina平台truseq文库)转换成兼容华大智造测序平台的带磷酸化的转化文库，再行单链成环状dna。经测试这款试剂的环化效率约5％，仅能满足说明书要求的最低质控要求。本技术方案经测试可稳定获得约15％的环化效率，增加了make dnb的成功率。

6、3)华大智造虽也针对转化文库推出了简便的试剂盒，如mgieasy通用文库转换试剂盒(app-a)将文库进行平台转化成app-a文库。再搭配dnbseq一步法dnb制备试剂盒(os-app-a)可实现环化、make dnb一步法完成，但目前仅支持最大pe100测序模式【https://www.mgi-tech.com/】。与当今应用广泛的pe150模式兼容性较弱。本技术通用mgiseq-200/2000/t7不同通量的测序仪，se50/pe100/pe150等不同测序模式，兼容性更强。

7、有鉴于此，特提出本技术。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本技术基于靶向捕获测序技术开展，提供了一种快速将常规illumina测序平台文库转化成可mgi平台测序的方法。较市场上其他同类型转化方法，在保持高转化效率的同时，可缩短整个操作流程约1h，并提高环化效率约10-20％。本技术操作简便、可实现illumina测序文库应用快速迁移至mgi测序平台，简化流程并解决了环化效率低的问题。

2、具体的，本技术技术方案如下：

3、本技术首先提供一种用于将illumina文库快速转化为可兼容mgi测序的文库的通用型扩增引物；

4、进一步的，所述引物针对illumina全长文库进行扩增；

5、进一步的，所述引物包含上游和下游引物；

6、进一步的，所述上下游任一引物的5’端包含磷酸化修饰，3’端无修饰。

7、优选的，所述引物序列长度为20-30nt；

8、在一些特定方式中，所述引物的包含如下序列：

9、引物1：5’phos-aatgatacggcgaccaccgag；

10、引物2：caagcagaagacggcatacgaga。

11、本技术还提供一种用于mgi平台文库转化的试剂，所述试剂包含上述通用型扩增引物。

12、进一步的，还包括基于illumina通用接头序列的环化步骤引物、连接及消化步骤体系。

13、优选的，所述环化试剂中包含的环化引物，所述环化引物序列与一条通用型扩增引物5’端5-20nt反向互补，与另一条通用型扩增引物5’端5-20nt碱基序列相同；在一些特定方式中，所述环化引物为app-a splint oligo，包含如下序列：

14、tcgccgtatcattcaagcagaagacg。

15、本技术还提供一种上述的通用型扩增引物，或上述的试剂在illumina文库快速转化为mgi平台中的应用。

16、本技术还提供一种将illumina文库快速转化为兼容mgi测序的文库的方法，所述方法包括如下步骤：

17、1)转化步骤：在illumina truseq二代文库构建实验体系下，在捕获扩增阶段添加上述的通用型扩增引物；

18、2)环化步骤：经环化制备单链mgi文库。

19、进一步的，所述1)转化步骤具体包括：

20、在全长illumina预文库经探针杂交捕获阶段，添加包含权利要求1-2任一所述的通用型扩增引物和hotstart dna聚合酶的扩增体系进行pcr扩增，形成带有磷酸化修饰的双链文库。

21、优选的，所述转化步骤不经过二次pcr扩增。

22、进一步的，所述2)环化步骤具体包括：

23、1)高温将带有磷酸化修饰的双链文库变性成单链文库，单链文库中添加环化引物，在高保真dna连接酶及连接稳定缓冲液作用下进行成环反应，形成单链核酸分子的中间环化产物；

24、2)利用核酸外切酶消化去除中间环化产物中未环化的单链核酸分子或已复性成双链的核酸分子，再利用磁珠进行体系置换获得纯化后单链环化产物。

25、进一步的，步骤1)中，所述高保真dna连接酶包括t4 dna连接酶、taq dna连接酶其中之一或全部；

26、进一步的，步骤1)中，所述连接稳定缓冲液包括二硫苏糖醇、甘油、tris hcl或氯化物其中之一或全部；

27、进一步的，步骤2)中，所述核酸外切酶包括核酸外切酶i或核酸外切酶ii其中之一或全部。

28、进一步的，上述任一所述illumina文库为兼容mgi测序仪se50、pe100或pe150测序模式的捕获文库，优选的为illumina全长truseq文库。

29、本技术有益技术效果：

30、1)本技术无需更换illumina平台文库构建中整个实验体系和试剂，仅需调换部分扩增引物即可完成测序平台的转换；区别于常规转化发生在捕获实验结束后的单独步骤，本技术在illumina全长truseq文库捕获后的扩增阶段进行转化，具有合并流程，减少试剂耗用及简化操作流程等优势。

31、2)本技术的通用型扩增引物用于捕获后扩增，文库根据需求可灵活调控双平台测序；另外，本技术使用hotstart dna聚合酶体系，其高保真特性即不仅具有5'-3'聚合酶活性，还包含3'-5'外切酶活性以在合成中校正错误碱基配对而暂停并修正，减少gc偏好、提高序列复制准确性。

32、3)本技术在文库构建环节即引入了磷酸化修饰，直接省略转换步骤，减少了转化试剂的使用，同时缩短了反应时间约1h。

33、4)本技术中搭配优化的环化组分，包括连接酶、环化引物、消化酶等，可提升环化效率约10-20％，整个反应时长缩短约0.5h。

34、5)本技术制备出的单链环状dna，可以作为下游mgi测序平台dna纳米球形成的原料。

35、6)本技术的方法适用于mgiseq-200/2000/t7等不同通量的测序仪，也适用于se50/pe100/pe150等不同测序模式，兼容性更强。