一种1型人博卡病毒型别特异性抗体及其应用的制作方法

本发明涉及免疫学和分子病毒学，具体涉及一种针对1型人博卡病毒的型别特异性单克隆抗体或其抗原结合片段、其制备方法及应用。

背景技术：

1、自2005年瑞典科学家allander等人首次在呼吸道感染患儿的鼻咽吸出物中发现人博卡病毒（human bocavirus，hbov）以来，各国研究学者又陆续发现了三种不同基因型别的hbov；迄今为止，hbov共有四个基因型别，分别命名为hbov1、2、3、4。越来越多的临床证据支持hbov1为下呼吸道感染的致病病毒，而hbov2～4主要在腹泻患儿的粪便标本中检出，这些感染肠道的hbovs尤其是hbov2在粪便标本中的检出率要高于其它基因型别，提示它们可能与儿童的急性胃肠炎有关。

2、hbov属于细小病毒科细小病毒亚科，博卡病毒属，是继细小病毒b19之后的第二个对人类致病的细小病毒科成员。hbov是一种单负链无包膜的dna病毒，直径约为25 nm，呈二十面体对称，基因组全长约为5kb。

3、hbov1具有细小病毒科特有的发卡结构，在3’（leh）端为兔耳朵型发卡，5’端（reh）为经典发卡。hbov1通过基因组左端启动子p5进行转录，经过rna剪接及加工形成不同长度的成熟mrna，继而进行病毒蛋白的表达。hbov1的基因组含有三个主要的开放阅读框orf，其中，3'端的orf编码非结构蛋白ns1、ns2、ns3、ns4；中间的orf编码非结构蛋白np1（其为博卡病毒属特有）；5’端的orf编码衣壳蛋白vp1、vp2、vp3，其中vp2、vp3基因编码区起始于vp1基因内部，是一个典型的重叠基因，所编码蛋白具有共同的羧基端。衣壳蛋白vp1：vp2：vp3表达比为1:1:10，vp3是形成二十面体衣壳的最主要蛋白，单独表达衣壳蛋白vp3可以自组装成病毒样颗粒，这样的病毒样颗粒具有很强的免疫原性，可诱导强烈的体液和细胞免疫反应。

4、由于hbov1、hbov2的vp3蛋白序列之间存在较高的同源性，且血清学研究中存在原始抗原效应（oas），因此，制备特异性针对hbov1或hbov2的、高亲和性的型别特异性抗体是特异性识别两种型别人博卡病毒从而对其进行鉴别诊断的关键。

技术实现思路

1、发明目的

2、针对现有技术中存在的问题或需求，本发明的目的在于提供一种具有较高亲和性的针对1型人博卡病毒的型别特异性单克隆抗体或其抗原结合片段、其制备方法及应用。

3、解决方案

4、为了实现上述目的，本发明经过大量的筛选获得了一种针对hbov1的型别特异性单克隆抗体，其能够以高亲和力特异性结合hbov1的vp3蛋白，而不结合hbov2的vp3蛋白，从而能特异性检测hbov1病毒感染。

5、具体地，本发明提供了如下技术方案：

6、第一方面，本发明提供了一种针对1型人博卡病毒的型别特异性单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中，

7、所述重链可变区包含：

8、氨基酸序列分别如seq id no: 1、seq id no: 2和seq id no: 3所示的三个互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3；

9、和/或，所述轻链可变区包含：

10、氨基酸序列分别如seq id no: 4、kvs和seq id no: 5所示的三个互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3。

11、作为优选，所述重链可变区还包含氨基酸序列分别如seq id no: 6、seq id no:7、seq id no: 8和seq id no: 9所示的框架区h-fr1、h-fr2、h-fr3和h-fr4；

12、和/或，所述轻链可变区还包含氨基酸序列分别如seq id no: 10、seq id no:11、seq id no: 12和seq id no: 13所示的框架区l-fr1、l-fr2、l-fr3和l-fr4。

13、进一步优选地，所述重链可变区包含如seq id no: 14所示的氨基酸序列或与seqid no: 14所示的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，或由其组成；

14、和/或，所述轻链可变区包含如seq id no: 15所示的氨基酸序列或与seq id no:15所示的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。

15、在优选的具体实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：

16、重链可变区，其氨基酸序列如seq id no: 14所示；和，

17、轻链可变区，其氨基酸序列如seq id no: 15所示。

18、在某些优选的具体实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段在其重链可变区和/或轻链可变区的n端还具有前导序列；优选地，所述重链可变区的前导序列具有如seqid no: 31所示的氨基酸序列，进一步优选地，所述前导序列由如seq id no: 32所示的核苷酸序列编码；优选地，所述轻链可变区的前导序列具有如seq id no: 33所示的氨基酸序列，进一步优选地，所述前导序列由如seq id no: 34所示的核苷酸序列编码。

19、此外，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括恒定区；优选地，所述恒定区为选自以下的任意一种：igg、iga或igm抗体的恒定区。

20、在优选的具体实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区和/或轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区的氨基酸序列如seq id no: 16所示；并且，优选地，所述轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no: 17所示。

21、在一些优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：

22、重链，其包含如seq id no: 18所示的氨基酸序列或与seq id no: 18所示的氨基酸序列具有至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，或由其组成；和，

23、轻链，其包含如seq id no: 19所示的氨基酸序列或与seq id no: 19所示的氨基酸序列具有至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。

24、进一步优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：

25、重链，其氨基酸序列如seq id no: 18所示；和，

26、轻链，其氨基酸序列如seq id no: 19所示。

27、在一些可行的实施方案中，所述单克隆抗体的抗原结合片段选自fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab、互补决定区片段、单链抗体、人抗体、嵌合抗体或双特异或多特异抗体。

28、第二方面，本发明提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。该多核苷酸不受限于其产生的方法，并且可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。

29、在可行的实施方案中，所述多核苷酸为多核苷酸组。

30、在一些优选的实施方案中，所述多核苷酸组包括：

31、(i)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的hcdr1、hcdr2和hcdr3的第一多核苷酸，优选地，所述第一多核苷酸为包含如seq id no: 20、21、22所示核苷酸序列（其可分别编码氨基酸序列如seq id no: 1、seq id no: 2和seq id no: 3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3）的dna分子或其相应的mrna分子；和，

32、(ii)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的lcdr1、lcdr2和lcdr3的第二多核苷酸，优选地，所述第二多核苷酸为包含如seq id no: 23、 aaagtttcc、seq id no: 24所示核苷酸序列（其可分别编码氨基酸序列如seq id no: 4、kvs和seq idno: 5所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3）的dna分子或其相应的mrna分子。

33、进一步优选地，所述多核苷酸组包括：

34、(i)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的第一多核苷酸，优选地，所述第一多核苷酸为包含如seq id no: 25所示核苷酸序列（其可编码氨基酸序列如seq id no: 14所示的重链可变区）和任选地如seq id no: 32所示核苷酸序列（其编码vh链n端的前导序列）的dna分子或其相应的mrna分子；和，

35、(ii)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的第二多核苷酸，优选地，所述第二多核苷酸为包含如seq id no: 26所示核苷酸序列（其可编码氨基酸序列如seq id no: 15所示的轻链可变区）和任选地如seq id no: 34所示核苷酸序列（其编码vl链n端的前导序列）的dna分子或其相应的mrna分子；

36、优选地，上述多核苷酸组还包括：

37、(iii)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链恒定区的第三多核苷酸，优选地，所述第三多核苷酸为包含如seq id no: 27所示核苷酸序列（其可编码氨基酸序列如seq id no: 16所示的重链恒定区）的dna分子或其相应的mrna分子；和，

38、(iv)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区的第四多核苷酸，优选地，所述第四多核苷酸为包含如seq id no: 28所示核苷酸序列（其可编码氨基酸序列如seq id no: 17所示的轻链恒定区）的dna分子或其相应的mrna分子。

39、在最优选的实施方案中，所述多核苷酸组包括：

40、(i)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链的第一多核苷酸，优选地，所述第一多核苷酸为核苷酸序列如seq id no: 29所示的dna分子或其相应的mrna分子，其可编码氨基酸序列如seq id no: 18所示的重链；和，

41、(ii)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链的第二多核苷酸，优选地，所述第二多核苷酸为核苷酸序列如seq id no: 30所示的dna分子或其相应的mrna分子，其可编码氨基酸序列如seq id no: 19所示的轻链。

42、第三方面，本发明提供了核酸构建体，其包含如上述第二方面所述的多核苷酸，以及，任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。

43、第四方面，本发明提供了一种重组载体，其包含如上述第二方面所述的多核苷酸，或者如上述第三方面所述的核酸构建体。

44、本发明的重组载体可以是克隆载体，也可以是表达载体，例如，可以是例如质粒，粘粒，噬菌体等。

45、在一些优选的实施方案中，所述重组载体为表达载体，优选为真核表达载体。

46、第五方面，本发明提供了一种转化的宿主细胞，其中转化有如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体或如上述第四方面所述的重组载体；

47、所述宿主细胞包括但不限于：原核细胞，例如大肠杆菌细胞；真核细胞，例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。所述宿主细胞还可以是细胞系，例如293t细胞系。

48、优选地，所述宿主细胞为真核细胞，进一步优选为哺乳动物细胞。

49、第六方面，本发明提供了一种用于检测1型人博卡病毒的试剂或试剂盒，其包括如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体和/或如上述第五方面所述的转化的宿主细胞。

50、在某些优选的实施方案中，所述试剂盒为检测或诊断试剂盒，其中所包含的本发明所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记；在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或者抗独特型抗体；优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记；此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。

51、第七方面，本发明提供了一种制备如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在适合于所述单克隆抗体或其抗原结合片段表达的条件下，使如上述第五方面所述的转化的宿主细胞表达所述单克隆抗体或其抗原结合片段，并从所述宿主细胞的培养物中回收所表达的单克隆抗体或其抗原结合片段。

52、第八方面，本发明提供了如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体、如上述第五方面所述的转化的宿主细胞、如上述第六方面所述的药物组合物和/或如上述第七方面所述的试剂盒在制备用于检测1型人博卡病毒在样品中的存在或其水平、用于诊断1型人博卡病毒感染、或用于1型人博卡病毒和2型人博卡病毒之间的鉴别诊断的产品中的应用。

53、在可行的实施方案中，所述样品为受试者的生物学样品；在具体实施方案中，所述样品为来自受试者的呼吸道样品，优选为鼻咽拭子、痰液和/或肺泡灌洗液。

54、第九方面，本发明提供了一种检测1型人博卡病毒在样品中的存在或其水平、或诊断1型人博卡病毒感染、或在1型人博卡病毒和2型人博卡病毒之间进行鉴别诊断的方法，所述方法包括使用如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体、如上述第五方面所述的转化的宿主细胞和/或如上述第六方面所述的试剂或试剂盒。

55、在该方法的一些优选实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。

56、在该方法的另一些优选实施方案中，所述方法还包括：使用携带可检测的标记的第二抗体，来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。

57、在可行的实施方案中，所述样品包括但不限于来自受试者的鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等呼吸道样品。

58、该方法可用于诊断目的(例如，所述样品是来自患者的样品)，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。

59、使用单克隆抗体或其抗原结合片段来检测目标病毒或抗原在样品中的存在或其水平的一般方法是本领域技术人员所熟知的。在某些优选的实施方案中，所述检测方法可以使用酶联免疫吸附(elisa)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。

60、有益效果

61、本发明的单克隆抗体能够与hbov1的vp3蛋白特异性结合，但与hbov2的vp3蛋白并不结合，因此，有着极高的潜力被用于1型人博卡病毒的特异性检测或诊断或用于1型人博卡病毒与2型人博卡病毒之间的鉴别诊断；并且，其与hbov1 vp3蛋白的结合亲和力较高，可为hbov1的检测提供更低的检测下线，从而提高了hbov1检测或诊断的灵敏度。