一种应用于肌酐检测的肌酸脒基水解酶突变体及其突变位点选择、纯化和检测方法与流程

本发明涉及蛋白质领域，尤其涉及一种一种应用于肌酐检测的肌酸脒基水解酶突变体及其纯化和检测方法。

背景技术：

1、肌酸脒基水解酶(creatinase，ec 3.5.3.3)是一种关键的酶，用于酶促检测法中测定肌酐含量。这种酶主要来源于微生物，如假单胞菌属、梭菌、黄杆菌属、芽孢菌属和产碱菌属等。肌酸脒基水解酶用于工业上测定肌酐含量，除此之外，在医疗诊断中也有重要应用。肌酐是应用人体磷酸肌酸代谢的最终产物，经肾脏过滤后，再从血液中进入尿液排出体外。通过检测血清和尿液中的肌酐含量，可以评估肾脏的排泄功能。肌酐是人体磷酸肌酸代谢的最终产物，经肾脏过滤后，血液中的肌酐会进入尿液并排出体外。正常情况下，人血清肌酐的正常范围应当小于150μm，但当肾功能或肌肉功能出现问题时，肌酐含量可能上升到1000μm。目前常用的肌酐检测方法有jaffe化学检测法和酶比色法。酶促检测法由于其较高的灵敏度和选择性等特点，越来越受到关注。然而，原始菌的肌酸脒基水解酶产量较低，且诱导剂价格昂贵，不适用于工业化生产。此外，肌酸脒基水解酶的底物亲和力低和差量不高等特点也限制了其在工业生产中的应用

2、目前，对肌酸脒基水解酶性质分析较为深入的菌株包括恶臭假单胞菌、节杆菌和产碱杆菌。绝大多数肌酸脒基水解酶的最适反应ph范围为7.0-8.0，在中性、弱碱和弱酸条件下保持稳定。通常情况下，大多数肌酸脒基水解酶的最适反应温度为30-40℃，当温度高于45℃时，活性则会迅速下降，因此，保持肌酸脒基水解酶的活性对于临床肌酐检测十分重要。

3、因此，本领域的技术人员致力于开发一种应用于肌酐检测的具有更高活性的肌酸脒基水解酶突变体。

技术实现思路

1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是获得一种具有更高活性的肌酸脒基水解酶突变体。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种应用于肌酐检测的肌酸脒基水解酶突变体，其特征在于，所述突变体为在af-cre蛋白的野生型氨基酸全长序列上进行单点突变的突变体，所述af-cre蛋白为来源于产碱杆菌alcaligenes faecalis的肌酸脒基水解酶即creatniase蛋白，所述af-cre蛋白的野生型氨基酸序列如seq id no.1所示。

3、在本发明的较佳实施方式中，所述单点突变的突变体选自以下任一种：全长单点突变体l131a如序列seq id no.2所示、全长单点突变体w59f如序列seq id no.3所示、全长单点突变体n13l如序列seq id no.4所示、全长单点突变体s93a如序列seq id no.5所示、全长单点突变体m5l如序列seq id no.6所示、全长单点突变体f133y如序列seq id no.7所示、全长单点突变体w90y如序列seq id no.8所示、全长单点突变体t27e如序列seq idno.9所示、全长单点突变体y310l如序列seq id no.10所示、全长单点突变体f256s如序列seq id no.11所示、全长单点突变体v33l如序列seq id no.12所示、全长单点突变体a180k如序列seq id no.13所示、全长单点突变体r239d如序列seq id no.14所示、全长单点突变体v241i如序列seq id no.15所示、全长单点突变体g392t如序列seq id no.16所示、全长单点突变体v395y如序列seq id no.17所示、全长单点突变体n130p如序列seq id no.18所示、全长单点突变体r104q如序列seq id no.19所示、全长单点突变体w313a如序列seq idno.20所示、全长单点突变体h74q如序列seq id no.21所示、全长单点突变体w36i如序列seq id no.22所示、全长单点突变体n31d如序列seq id no.23所示、全长单点突变体t117a如序列seq id no.24所示和全长单点突变体i204v如序列seq id no.25所示。

4、本发明还提供一种应用于肌酐检测的肌酸脒基水解酶突变体蛋白的突变位点选择方法，其特征在于，通过已有的非监督模型对af-cre野生型氨基酸序列借助深度学习进行改造靶点打分，辅以af-cre野生型蛋白的晶体结构或者同源建模的结构共进化分析来选择靶标位点，在分数从高到低的排序中，将距离最近的酶活性点位大于的氨基酸残基作为突变点位的靶标位点。本发明还包括前述的应用于肌酐检测的肌酸脒基水解酶突变体蛋白的表达与纯化方法，其特征在于，所述方法包括合成单点突变质粒并转化至大肠杆菌；将甘油管中的工程菌按照2％的比例接种到5ml的含有100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基试管中，于37℃、220rpm的摇床上培养12h，取4ml菌液至含有100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基的500ml摇瓶中，37℃、220rpm培养2h，当菌体od600达到0.8-1.0时，添加浓度为0.1mm的iptg后移至18℃摇床诱导培养14-16h。

5、在本发明的较佳实施方式中，所述质粒为pet28aaf-cre质粒。

6、在本发明的另一较佳实施方式中，所述大肠杆菌种类为bl21 de3。

7、在本发明的另一较佳实施方式中，所述方法还包括，将摇床诱导培养的菌体4000rpm离心15-20min收集菌体，超声破碎后，10000rpm高速离心并取上清液，进行ni nta纯化层析处理，将蛋白分成小份，经液氮速冻后，储存在80℃。

8、本发明还提供所述的应用于肌酐检测的肌酸脒基水解酶突变体蛋白的稳定性检测方法，其特征在于，所述方法包括：

9、配置磷酸盐缓冲液，用缓冲液将纯化得到的多种肌酸脒基水解酶突变体蛋白浓度稀释至0.3～0.5mg/ml，将蛋白装入八连管，采用荧光定量pcr测量解折叠温度tm用以表征热稳定性，每个实验做三个重复。

10、在本发明的佳实施方式中，所述磷酸盐缓冲液为1×pbs，ph为8.0。

11、本发明还包括前述的应用于肌酐检测的肌酸脒基水解酶突变体蛋白的活性检测方法，其特征在于，所述方法包括：采用磷酸盐缓冲液将纯化得到的多种肌酸脒基水解酶突变体蛋白稀释到1mg/ml.配置0.1m浓度的肌酸溶液；将2g对二甲基苯甲醛溶解于100ml的二甲基亚砜中，并加入15ml的浓盐酸配置成终止液；在ep管中加入280μl的肌酸溶液并在37℃水浴5min，而后加入20μl的突变体蛋白溶液开始肌酸水解反应，反应进行20min后加入终止液终止反应；采用酶标仪在435nm测量产物的吸光值。

12、技术效果

13、为了更好的将肌酸脒基水解酶应用于临床肌酐检测，本发明了通过机器学习辅助的定点突变的方式制造了活性提高的的肌酸脒基水解酶突变体，获得了活性提升且保有一定热稳定性的突变体酶，并且提供了相应的蛋白纯化和活性稳定性检测方法，解决了现有的肌酸脒基水解酶活力较差的缺陷不能满足应用于试剂的需求，为进一步拓宽肌酸脒基水解酶的工业应用奠定了基础。

14、以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。