一种鉴别羊骨成分的特异性引物、试剂盒及鉴别方法与流程

本发明属于中药材鉴定，具体涉及一种鉴别羊骨成分的特异性引物、试剂盒及鉴别方法。

背景技术：

1、尪痹胶囊由地黄、熟地黄、续断、羊骨等17味中药制成，具有补肝肾，强筋骨，祛风湿，通经络的作用。现代临床常用于肝肾不足，风湿阻络所致的尪痹，症见肌肉、关节疼痛，局部肿大、僵硬畸形，屈伸不利，腰膝酸软，畏寒乏力；类风湿性关节炎等。其组成中含有大量羊骨，羊骨中含有磷酸钙、碳酸钙、骨胶原、骨类粘蛋白、弹性硬蛋白样物质、中性脂肪、磷脂和糖原等成分。其性味肝温，有补肾、强筋的作用。可用于血小板减少性紫癜、再生不良性贫血、筋骨疼痛、要软乏力、白浊、淋痛、久泻、久痢等病症。

2、传统的尪痹胶囊的真伪鉴别方法通过采用薄层色谱法对方中的白芍、知母进行鉴别；采用高效液相色谱法对淫羊藿苷进行定量分析，无法鉴别其中的羊骨成分。

3、针对动物源性成分鉴别的专利涉及有“一种鉴别牛羊猪源性成分的引物组及试剂盒(公开号为cn104789692a)、一种快速鉴别猪羊牛动物源性成分的多重pcr引物体系及鉴别方法(公开号为cn105177150a)”等。

4、以上两个专利均是对羊肉或者肉骨混合物的直接产品(羊肉或者肉骨)进行鉴定，难度相对较低，直接提取即可得到高质量dna，而相对于，羊肉或者肉骨混合物而言，单纯羊骨中所含细胞较少，且尪痹胶囊为深加工药品，在尪痹胶囊的生产过程中，羊骨经高温长时间煎煮和干燥，dna遭到严重破坏，成品中dna含量少而且片段极短，而且，尪痹胶囊中含有多种原料药，各原料药中大量蛋白的存在会严重影响dna提取的效率，以上原因使得尪痹胶囊中羊骨成分的鉴别难度很大，使用上述现有技术的方法鉴定尪痹胶囊中羊骨成分时，易出现扩增不出来，杂带等问题，准确度、灵敏度低，特异性差，均不适用于对尪痹胶囊的鉴别。

技术实现思路

1、本发明要解决的第一个技术问题在于提供一种用于鉴别羊骨成分的引物组合物，采用所述引物鉴别羊骨成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中羊骨成分进行快速鉴定，效率高。

2、本发明要解决的第二个技术问题在于提供一种用于鉴别羊骨成分的产品，采用所述产品鉴别羊骨成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中羊骨成分进行快速鉴定，效率高。

3、本发明要解决的第三个技术问题在于提供一种用于鉴别羊骨成分的方法，采用所述方法鉴别羊骨成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中羊骨成分进行快速鉴定，效率高。

4、为此，本发明提供了一种用于鉴别羊骨成分的引物组合物，其特征在于，所述引物包括：

5、上游引物：5′-cacagccctcgccatagtc-3′；

6、下游引物：5′-agttgtctgggtctccgagtag-3′。

7、本发明提供了一种产品，所述产品包括所述的引物组合物和上述任一项所述的探针。

8、进一步地，所述产品为试剂盒，所述试剂盒还包括pcr反应缓冲液以及dna聚合酶。

9、本发明还提供了一种所述的引物组合物或所述的产品在鉴别样品中羊骨成分的的应用；优选的，所述样品为含有羊骨成分的药品；更优选的，所述样品为尪痹胶囊。

10、本发明还提供了一种鉴别羊骨成分的方法，包括如下步骤：

11、(1)提取待测样品中的核酸，得dna模板；

12、(2)使用所述的引物对步骤(1)获得的dna模板进行pcr扩增，得扩增产物；

13、(3)测定步骤(2)中所得的pcr扩增产物的大小，若所述pcr扩增产物中含有170～210bp的dna片段，则所述待测样品中存在羊骨成分；反之，则所述待测样品中不存在羊骨成分。

14、进一步地，步骤(1)中采用chelex-100树脂提取样品中的核酸；

15、优选的，所述提取样品中的核酸的具体步骤为：取待测样品0.1～1重量份，加0.5～2体积份含有chelex-100树脂的缓冲液，90～100℃下水浴加热，于-4～4℃下静置0.5～2min，固液分离，吸取液体，即得预处理样品；所述重量份和体积份的比值关系为mg/ml。

16、进一步地，在步骤(2)中，所述pcr反应体系包括：

17、dna模板，50ng/μl，1～5μl；

18、上游引物，10μm，0.5～1.5μl；

19、下游引物，10μm，0.5～1.5μl；

20、taq dna聚合酶，5u/μl，5～15μl；

21、ddh2o，4～8μl；

22、优选的，所述pcr扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，48～68℃退火30s，72℃延伸1min，进行30～35个循环；然后继续72℃延伸5～10min，获得的扩增产物4℃保存。

23、优选的，所述pcr扩增程序中，退火温度为60℃。

24、所述步骤(3)中，所述170～210bp的dna片段为176bp的dna片段。所述的176bp的dna片段序列如seq id no：9所示，具体为tttccttcacgaaacaggatctaacaaccccacaggaatcccatcagacgcagacaaaatcccgtttcacccttactacaccattaaagatatcctaggcgctatactgctgatcctcgccctgatattactagtattattcacacccgacctactcggagacccagacaactata。

25、本发明技术方案，具有如下优点：

26、(1)本发明所述的用于鉴别羊骨成分的引物组合物，本发明人是在前期研究中通过对多个鉴别基因片段进行筛选分析后，并基于这些基因片段分别设计了引物，且通过对这些引物的筛选研究，筛选出了本发明的具有高种属特异性的引物，使用本发明提供的引物对样品中的羊骨成分进行鉴定，具有结果准确、灵敏度高、结果稳定可靠且假阳性率低的优点，并能将羊骨成分与其他亲源关系比较近的种属混淆品准确的分开，特异性高。

27、(2)本发明所述的用于鉴别羊骨成分的引物组合物，其中优选采用引物及探针1，扩增得到的pcr扩增产物仅为176bp，分子量小，扩增效率更高，保证了其在短时间内进行大量的食品中羊骨成分鉴定。

28、(3)本发明所述的鉴别羊骨成分的方法，采用170～210bp的dna片段为目的基因的引物进行pcr扩增，保证了其在短时间内进行大量的样品中羊骨成分鉴定，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高。

技术特征：

1.一种鉴别羊骨成分的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括：

2.一种鉴别羊骨成分的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的引物组合物。

3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒，所述试剂盒还包括pcr反应缓冲液以及dna聚合酶。

4.权利要求1所述的引物组合物或权利要求2或3所述的产品在鉴别样品中羊骨成分的的应用；优选的，所述样品为含有羊骨成分的药品；更优选的，所述样品为尪痹胶囊。

5.一种鉴别羊骨成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中采用chelex-100树脂提取样品中的核酸；

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述pcr反应体系包括：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增程序中，退火温度为60℃。

9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述170～210bp的dna片段为176bp的dna片段。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的176bp的dna片段序列如seq idno：9所示。

技术总结
本发明属于中药材鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别羊骨成分的特异性引物、试剂盒及鉴别方法。本发明所述的用于鉴别羊骨成分的引物组合物，本发明人是在前期研究中通过对多个鉴别基因片段进行筛选分析后，并基于这些基因片段分别设计了引物，且通过对这些引物的筛选研究，筛选出了本发明的具有高种属特异性的引物，使用本发明提供的引物对样品中的羊骨成分进行鉴定，具有结果准确、灵敏度高、结果稳定可靠且假阳性率低的优点，并能将羊骨成分与其他亲源关系比较近的种属混淆品准确的分开，特异性高。

技术研发人员：刘晖晖,袁际云,韩凌,邵平,马诗琳,蒋福宇,崔长升,左春颖
受保护的技术使用者：辽宁华润本溪三药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1