跨菌种启动子、多菌种穿梭质粒及其应用

本发明涉及生物工程，具体涉及一种跨菌种启动子、多菌种穿梭质粒及其应用。

背景技术：

1、在发酵工程和细胞代谢工程中，需要对宿主微生物细胞合成外源有关化合物的代谢途径进行构建。但由于外源基因不同，对于不同的宿主微生物细胞往往具有不同的宿主表达适应性，故而在传统上，对于陌生的外源基因表达，往往需要在包括大肠杆菌在内的多个宿主中研究和表征，才能筛选出最合适的外源基因表达宿主。通常在得到最佳表达宿主后，需要在大肠杆菌细胞内进行基因扩增等一系列基因工程操作，然后再转移到表达宿主中进行表达。

2、为了更便捷的进行构建操作，科研人员开发了穿梭型的质粒载体，其具有在不同宿主细胞中转移的能力，例如：枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒等。但目前很少有对多菌种穿梭质粒的构建研究，对两个以上的宿主进行基因表达操作及代谢途径构建仍然较为繁琐。并且，对于不同宿主之间的天然启动子具有不兼容性，当需要同一基因在不同宿主之间进行表达时，其基因表达盒的每一次转移都需要更换适应于该宿主的启动子。

3、因此，提供一种能够在多种宿主细胞之间穿梭，能稳定存在并表达其上携带的目的基因，便于代谢通路构建的质粒是本领域技术人员需要解决的一个技术问题。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明构建了一种跨菌种启动子及多菌种穿梭质粒，该穿梭质粒能够同时应用于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母的基因工程操作。质粒携带的跨菌种启动子可以启动至少包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母五种微生物宿主细胞的基因表达，有效提高了基因表达及代谢途径构建效率。

2、本发明的第一个目的是提供一种跨菌种启动子，该启动子上包含原核部分和真核部分，可在不同原核生物和真核生物中启动目的基因的表达。所述跨菌种启动子中含有转录因子结合位点、up序列、核心骨架、核糖体结合位点和kozak序列，其中：

3、(1)up序列位于转录因子结合位点与核心骨架之间且转录因子结合位点位于核心骨架上游，核糖体结合位点和kozak序列位于核心骨架下游；所述转录因子结合位点选自seq id no.7-11所示序列之一，up序列选自seq id no.3-6所示序列之一，核心骨架的序列如seq id no.2所示；

4、或(2)转录结合位点位于核心骨架上游，且up序列位于所述核心骨架中，核糖体结合位点和kozak序列位于核心骨架下游；所述转录因子结合位点选自seq id no.7-11所示序列之一，up序列选自seq id no.3-6所示序列之一，核心骨架的序列如seq id no.2所示，up序列插入位点为核心骨架序列的第18个碱基与第19个碱基之间。

5、进一步地，所述核糖体结合位点的序列如seq id no.12所示。

6、进一步地，所述kozak序列如seq id no.13所示。

7、本发明的跨菌种启动子不仅具备结合原核生物σ70、σn、σb和σd的结合位点序列、up序列及rbs序列，且具备转录因子cat8、tye7、hap4、abf1、gat1、gln3、gcr2、stp1、upc2、gal4-like、swi5的结合序列。序列排列组合均经过理性设计。所述的启动子在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母及毕赤酵母等细胞内皆具备活性，并可以启动目的基因的转录。

8、本发明的第二个目的是提供一种携带上述跨菌种启动子的多菌种穿梭质粒。

9、进一步地，所述多菌种穿梭质粒上含有宿主菌的复制位点和/或整合位点。

10、进一步地，所述多菌种穿梭质粒为用于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母中两种或多种之间的穿梭质粒。

11、进一步地，所述多菌种穿梭质粒上连接有大肠杆菌复制子、枯草芽孢杆菌复制子、谷氨酸棒杆菌复制子、酿酒酵母复制子或整合位点、毕赤酵母整合位点中的一种或多种。

12、进一步地，大肠杆菌复制位点为cole1，枯草芽孢杆菌复制位点为repb，酿酒酵母复制位点为2μm ori。

13、进一步地，酿酒酵母基因组整合位点为ura3序列，毕赤酵母基因组整合位点为his序列。

14、进一步地，所述多菌种穿梭质粒的构建方法，包括以下步骤：

15、s1、设计跨菌种启动子：合成特定引物，引物带有σ70、σn、σb和σd的结合位点序列，及up序列，引物之间带有同源臂序列，便于后续dna组装过程。对酿酒酵母和毕赤酵母内源组成型启动子及其核心启动子进行活性检测，并分析较优启动子的转录因子结合位点，优选的，合成转录因子cat8、tye7、hap4、abf1、gat1、gln3、gcr2、stp1、upc2、gal4-like、swi5的dna结合序列。

16、s2、合成大肠杆菌复制位点cole1序列，枯草芽孢杆菌复制位点repb序列，酿酒酵母复制位点2μm ori序列和毕赤酵母整合位点his序列。

17、s3、以py26等质粒为骨架，通过将跨菌种启动子与各菌复制位点通过同源臂组装得到多菌种穿梭质粒。

18、本发明的第三个目的是提供一种含有所述跨菌种启动子或多菌种穿梭质粒的宿主细胞。

19、本发明的第四个目的是提供所述跨菌种启动子或多菌种穿梭质粒在基因工程改造中的应用。如在微生物细胞代谢工程领域中的应用，包括外源基因的表达，细胞代谢通路的构建。

20、本发明的第五个目的是提供所述跨菌种启动子或多菌种穿梭质粒在合成生物学领域中的应用，包括生物传感器元件的构建、基因电路设计及底盘细胞筛选。

21、本发明的第六个目的是提供一种筛选基因工程宿主菌的方法，包括以下步骤：

22、将目的基因连接至所述多菌种穿梭质粒中的跨菌种启动子之后，随后分别导入待选宿主菌中，并根据目标信号进行筛选。

23、本发明的第七个目的是提供一种用于宿主筛选的表达系统，所述表达系统中含有上述跨菌种启动子或多菌种穿梭质粒。

24、本发明的第八个目的是提供一种重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母中至少含有由所述跨菌种启动子启动的mt-ox酶编码基因和eevs酶编码基因。

25、进一步地，以毕赤酵母gs115为出发菌株。

26、本发明的第九个目的是提供一种生产gadusol的方法，采用所述重组毕赤酵母进行发酵生产。

27、本发明的有益效果：

28、本发明实现了一种可以同时构建大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母的分子操作质粒及外源基因表达的启动子，解决了多宿主遗传操作质粒载体工具缺乏、不同宿主间天然启动子不能识别的问题，有效的提高了基因表达及代谢途径构建效率。本发明为细胞工厂代谢途径构建、合成生物学基因表达元件开发等研究和应用提供了良好的基础。

技术特征：

1.一种跨菌种启动子，其特征在于，所述跨菌种启动子中含有转录因子结合位点、up序列、核心骨架、核糖体结合位点和kozak序列，其中：

2.携带权利要求1所述跨菌种启动子的多菌种穿梭质粒。

3.根据权利要求2所述的多菌种穿梭质粒，其特征在于，所述多菌种穿梭质粒上含有宿主菌的复制位点和/或整合位点。

4.根据权利要求2所述的多菌种穿梭质粒，其特征在于，所述多菌种穿梭质粒用于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母中两种或多种宿主之间的穿梭。

5.含有权利要求1所述跨菌种启动子或权利要求2-4任一项所述多菌种穿梭质粒的宿主细胞。

6.权利要求1所述跨菌种启动子或权利要求2-4任一项所述多菌种穿梭质粒在基因工程改造或生物合成中的应用。

7.一种筛选基因工程宿主菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：将目的基因连接至权利要求2-4任一项所述多菌种穿梭质粒中的跨菌种启动子之后，随后分别导入待选宿主菌中，并根据目标信号进行筛选。

8.一种可在不同宿主中穿梭的表达系统，其特征在于，所述表达系统中含有权利要求1所述跨菌种启动子或权利要求2-4任一项所述多菌种穿梭质粒。

9.一种重组毕赤酵母，其特征在于，所述重组毕赤酵母至少包括以下改造：过表达由权利要求1所述跨菌种启动子启动的mt-ox酶编码基因和eevs酶编码基因。

10.一种生产gadusol的方法，其特征在于，采用权利要求9所述重组毕赤酵母进行发酵生产。

技术总结
本发明公开了跨菌种启动子、多菌种穿梭质粒及其应用，尤其是设计了一种大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母通用的启动子，该启动子可以在上述宿主内具有活性并且启动目的基因的转录。本发明有效解决了合成生物学和代谢工程中对目的基因进行不同宿主表达验证、最优底盘细胞的构建没有足够通用的启动子工具的问题。通过利用本发明构建的跨菌种启动子和多菌种穿梭质粒，可以在不同宿主细胞内快速对目的基因表达情况进行筛选，获得最佳表达宿主，并有效扩充了合成生物学工具箱，为复杂基因电路构建提供了良好的基础元件。

技术研发人员：康振,陈坚,左文杰,彭安祺,堵国成,王阳,李江华
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25