一种肿瘤T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用

本发明涉及生物，具体地，涉及一种肿瘤t细胞抗原表位肽、pmhc及其制备和应用。

背景技术：

1、肿瘤的发生率和死亡率在全球范围内呈现逐年升高的势态，目前存在的最主要问题是缺乏有效的治疗手段。肿瘤免疫治疗是指外源干预机体免疫系统，重新启动并维持“肿瘤-免疫”循环，恢复、提高机体的抗肿瘤免疫反应，加强对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，从而达到控制甚至特异性清除肿瘤的治疗效果。与手术、放疗和化疗等传统的治疗手段相比，肿瘤免疫治疗具有特异性强，副作用小的优点，目前，已应用在临床上的肿瘤免疫治疗方法主要包括免疫检查点抑制剂治疗、过继性细胞免疫治疗、癌症疫苗及一些新兴免疫治疗方法等。癌症的免疫疗法被科学杂志评为2013年度十大科学突破之首，也是目前被广泛研究与开发的新型抗肿瘤治疗手段。

2、癌症免疫循环包括几个步骤：癌细胞产生的抗原在癌细胞死亡后释放并被树突状细胞(dc)捕获。接下来，dc将mhc分子上捕获的抗原呈递给t细胞，从而引发和激活效应t细胞对癌症抗原的反应。在趋化因子的引导下，活化的t细胞进入并浸润肿瘤部位。t细胞通过tcr与抗原-mhc复合物的相互作用特异性识别并结合癌细胞并杀死癌细胞。因此，t细胞免疫应答在抗肿瘤免疫防御中具有重要作用，在疫苗研发中占据重要地位。cd8+t细胞免疫应答的第一步就是t细胞通过其表面的抗原识别受体特异性识别被癌细胞所递呈的抗原表位肽。因此，抗原表位肽是t细胞特异性识别肿瘤细胞、发挥免疫保护作用的重要关键分子，是免疫检测、免疫治疗和疫苗研发的关键靶向分子。

3、嵌合抗原受体t细胞技术(car-t)以及t细胞受体嵌合型t细胞(tcr-t)作为当前最新的两大免疫细胞技术，受到广泛的关注和研究。car-t细胞治疗在血液肿瘤中已经取得较好的疗效，但其引起的细胞因子风暴和神经毒性副作用可能会危及生命。而tcr-t细胞治疗是对实体瘤有效的免疫细胞治疗手段之一，将能识别肿瘤特异性抗原的tcrα和β链基因转染到t细胞中，修饰t细胞使其表达肿瘤抗原特异性的tcr抗原结合区，从而能特异性识别相应的肿瘤抗原。然后经体外扩增并回输到人体内，表达肿瘤抗原特异性tcr的t淋巴细胞可识别肿瘤细胞表面的hla-抗原肽复合物，进而引发t细胞的免疫效应，达到杀伤肿瘤细胞的目的。肿瘤疫苗是利用肿瘤相关抗原(taas)、肿瘤多肽或肿瘤细胞裂解产物等诱导机体产生肿瘤特异性免疫应答，保护机体免受肿瘤细胞侵袭，实现对肿瘤的预防和治疗。包括预防性肿瘤疫苗和治疗性肿瘤疫苗两大类。治疗性肿瘤疫苗主要针对肿瘤患者，通过免疫诱导病人体内产生特异性抗体、效应细胞和特异性免疫记忆细胞，达到治疗肿瘤的目的。已有临床试验证实肿瘤全细胞疫苗、肿瘤特异性蛋白或多肽疫苗以及肿瘤核酸疫苗在肿瘤治疗过程中展现了巨大的应用潜力。

4、mage家族是原癌抗原，是癌睾丸(cancer/testis antigen)抗原超家族成员之一。mage家族成员超过60个，均存在于同一个mage同源结构域。主要分为两个亚类：mage-i类抗原和mage-ii类抗原。mage-ii类抗原的表达普遍存在于正常细胞中，而mage-i类抗原为taas，即在人体除睾丸生殖细胞和胎盘滋养组织以外的组织中均不表达，却在肿瘤中高表达，是肿瘤研究中的热点。由于生殖细胞缺乏hla因而癌睾丸抗原不能被t细胞识别，但在恶性肿瘤中癌睾丸抗原和hla分子同时表达则可以被t细胞识别。mage-i类抗原可划分为三个亚类：mage-a、mage-b和mage-c。mage-a亚家族具有严格的表达模式，其中mage-a3，mage-a4，mage-a10及mage-a12等是mage家族中具有独特特征的一个抗原，在黑色素瘤、肝癌、肺癌和食管癌等患者中存在特异性高表达。近年来，以mage-a家族基因为靶点的抗癌作用常用两种方法：(1)接种mage表位抗原疫苗；(2)tcr-t免疫细胞治疗。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种肿瘤t细胞表位肽、pmhc及其制备和应用。

2、本发明的第一目的是提供一种肿瘤t细胞抗原表位肽。

3、本发明的第二目的是提供一种肿瘤t细胞抗原表位肽组合物。

4、本发明的第三目的是提供一种pmhc复合物。

5、本发明的第四目的是提供一种抗原肽-抗原递呈细胞复合物。

6、本发明的第五目的是提供一种编码上述肿瘤t细胞抗原表位肽的基因。

7、本发明的第六目的是提供上述肿瘤t细胞抗原表位肽、肿瘤t细胞抗原表位肽组合物、pmhc复合物、抗原肽-抗原递呈细胞复合物和/或基因在制备肿瘤疫苗和/或肿瘤药物中的应用。

8、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

9、t2-a2是一种通过重组基因工程技术表达人mhc-i类分子hla-a2的抗原递呈细胞系。只有有效的抗原表位肽才能被其递呈，从而在其细胞表面形成稳定的pmhc复合物，因此可以作为刺激t细胞的人工抗原递呈细胞。

10、t细胞抗原表位肽单独无法工作，必须以pmhc复合物或抗原肽-抗原递呈细胞复合物的方式进行t细胞活化。本发明利用mhc的单体和鉴定出的新型肿瘤t细胞表位进行联合复性，制备了pmhc复合物。将鉴定出的新型肿瘤t细胞抗原表位肽负荷在抗原递呈细胞表面(t2-a2细胞)，制备了抗原肽-抗原递呈细胞复合物，然后用制备好的pmhc复合物去标记t细胞，发现其抗原表位肽可以有效活化健康人外周血中t细胞产生杀伤性细胞因子，也可以有效杀伤携带肿瘤mage-a3，mage-a10抗原的靶细胞。该t细胞抗原表位肽组装成pmhc复合物，可以在非小细胞肺癌患者外周血中检测到。证明新发现的mage-a3和mage-a10 t细胞抗原表位肽能有效诱导t细胞免疫，可以应用于肿瘤通用型疫苗和免疫细胞治疗手段，如tcr-t的开发。

11、因此本发明请求保护一种肿瘤t细胞抗原表位肽，所述肿瘤t细胞抗原表位肽的氨基酸序列如seq id no：1～seq id no：3任一所示。

12、mage-a3-mp4(seq id no：1)：lvfgielmev；

13、mage-a10-mp30(seq id no：2)：viwealnmm；

14、mage-a10-mp32(seq id no：3)：sllkflakv。

15、本发明还请求保护一种肿瘤t细胞抗原表位肽组合物，所述肿瘤t细胞抗原表位肽含有氨基酸序列如seq id no：1～seq id no：3所示的肿瘤t细胞抗原表位肽中的一条或多条。

16、本发明还请求保护一种pmhc复合物，所述pmhc复合物含有上述肿瘤t细胞抗原表位肽和/或上述肿瘤t细胞抗原表位肽组合物。

17、优选地，所述pmhc复合物的制备方法为：将hla-a2重链、hla-a2轻链β2m和上述肿瘤t细胞抗原表位肽复性得到。

18、本发明还请求保护一种抗原肽-抗原递呈细胞复合物，所述抗原肽-抗原递呈细胞复合物为表面有上述肿瘤t细胞抗原表位肽和/或上述肿瘤t细胞抗原表位肽组合物的抗原递呈细胞。

19、优选地，所述抗原递呈细胞为t2-a2细胞。

20、更优选地，所述t2-a2细胞为过表达hla-a2的t2细胞。

21、更优选地，所述抗原肽-抗原递呈细胞复合物的制备方法为：将上述肿瘤t细胞抗原表位肽与抗原递呈细胞混合孵育，得到抗原肽-抗原递呈细胞复合物。

22、本发明还请求保护一种编码上述肿瘤t细胞抗原表位肽的基因。

23、本发明还请求保护上述肿瘤t细胞抗原表位肽、肿瘤t细胞抗原表位肽组合物、pmhc复合物、抗原肽-抗原递呈细胞复合物和/或基因在制备肿瘤疫苗和/或肿瘤药物中的应用；所述肿瘤为肺癌。

24、优选地，所述肿瘤还包括mage-a3和/或mage-a10高表达的肿瘤。

25、更优选地，所述mage-a3和/或mage-a10高表达的肿瘤为黑色素瘤、肝癌和/或食管癌。

26、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

27、本发明发现了3种肿瘤t细胞抗原表位肽，可用于体外的t细胞活化实验。所述肿瘤t细胞抗原表位肽可以应用到针对mage-a3和mage-a10抗原高表达的肿瘤如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝癌、头颈肿瘤等肿瘤通用疫苗的研发、肿瘤的诊断以及tcr-t疗法的研究中。

28、本发明所述肿瘤t细胞抗原表位肽制备成pmhc复合物或直接负荷导抗原递呈细胞，从而活化t细胞，可应用于：

29、(1)肿瘤疫苗的研发和制备：肿瘤细胞死亡后释放肿瘤抗原，dc将mhc分子上捕获的抗原呈递给t细胞，从而引发和激活效应t细胞对癌症抗原的反应，本发明所述肿瘤t细胞抗原表位肽能诱导机体产生免疫应答生成抗原特异性t细胞，故本发明所述肿瘤t细胞抗原表位肽是肿瘤通用疫苗的候选抗原表位肽。

30、(2)检测机体是否具有抗肿瘤的细胞免疫功能：待检者体内检测到肿瘤抗原特异性t细胞，代表机体已经产生了t细胞免疫功能，根据该抗原表位肽制备成的pmhc复合物标记的抗原特异性cd8t的比例，反应待检者抗肿瘤免疫反应的强弱。

31、(3)辅助诊断：使用本发明所述肿瘤t细胞抗原表位肽或肿瘤t细胞抗原表位肽组合物可检测出特异性免疫反应成分，从而提高诊断的特异性，并快速筛查出mage-a3或mage-a10抗原阳性的肿瘤患者。

32、(4)tcr-t细胞免疫疗法开发。