一种缺失yycI基因的底盘菌株及其应用

本发明属于基因工程和酶工程领域，涉及工业微生物的育种，特别涉及一种用于生产蛋白酶的底盘菌株及其构建方法。

背景技术：

1、碱性蛋白酶(alkaline protease)，一类能够催化水解肽键的酶，在ph值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，不但能水解肽键，还具有水解酰胺键、酯键以及转酯和转肽的功能。碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高等优势，具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，且相对中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性且有一定的酯酶活力，易于实现工业化生产。

2、氨肽酶(aminopeptidase)作为一种外肽酶，能够特异性的识别蛋白和多肽链n末端的氨基酸残基，并将其逐个水解下来，与碱性蛋白酶、羧肽酶等协同水解可有效减轻蛋白水解液中的苦味，制备出多种生物活性肽，在食品、医疗行业等具有广阔的应用前景。但是氨肽酶目前产量较低，因此提高氨肽酶的表达量，为提高氨肽酶的应用效果，拓宽其应用领域具有重要价值。

3、角蛋白酶(keratinase)是一种可专一地降解角蛋白的蛋白酶类，角蛋白酶可由多种微生物产生，能特异性地降解角蛋白，在饲料、皮革、医药业、食品等工业及环境治理方面具有广阔的应用前景，但是角单白酶目前产量较低，因此提高表达量，提高应用效果，拓宽其应用领域具有重要价值。

4、解淀粉芽胞杆菌作为一类好氧、产芽胞的革兰氏阳性菌，具有遗传背景清楚、生长速度快、适应能力强、非致病性、分泌蛋白能力强、重组dna比较容易转入的特点和良好的发酵基础及生产技术，并且已被美国食品药品管理局(fda)认定为安全生产菌株。作为重要的异源蛋白生产宿主，其蛋白分泌能力要高于常见的蛋白生产模式菌株—枯草芽胞杆菌，但目前仅限于少量工业化酶的生产。

5、在生产异源蛋白过程中，生产菌株的活性保持是保证异源蛋白高产量的基础，然而在发酵过程中由于存在营养缺乏，生长环境压力，次级代谢产物和产物酶的积累以及菌体自然生长的限制导致了菌体死亡。细菌死亡会影响异源蛋白的生产，极大限制了持续表达外源蛋白的能力。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的是通过对基因工程宿主的改造，提供一种有利于蛋白酶异源生产的的解淀粉芽孢杆菌底盘菌株。

2、为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，该基因工程菌不表达解淀粉芽孢杆菌基因组上的六种胞外蛋白酶基因apre，bpr，vpr，mpr，npre，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs，sacb基因，和双组分系统调节蛋白yyci基因。

4、第二方面，本发明提供了一种生产氨肽酶的基因工程菌，其是在第一方面基因工程菌的基础上，异源过表达氨肽酶基因。

5、第三方面，本发明提供了一种生产碱性蛋白酶的基因工程菌，其是在第一方面基因工程菌的基础上，异源过表达碱性蛋白酶基因。

6、第四方面，本发明提供了一种生产角蛋白酶的基因工程菌，其是在第一方面基因工程菌的基础上，异源过表达角蛋白酶基因。

7、第五方面，本发明提供了利用如上述第一方面至第四方面的基因工程菌生产蛋白酶的方法，包括：在培养基中培养所述基因工程菌以使其生产蛋白酶；以及，从所述基因工程菌和/或所述培养基中收集所述蛋白酶。其中，所述蛋白酶选自氨肽酶、碱性蛋白酶或角蛋白酶。

8、本发明的有益效果如下：

9、先前研究中获得的解淀粉芽孢杆菌(参见专利cn116218750a)在发酵后期生长活力下降，活菌个数减少，生产蛋白的能力减弱，所以需要对菌株进行改造，提高生产异源蛋白的能力。本发明通过对解淀粉芽孢杆菌基因组上的双组分系统调节蛋白yyci基因进行敲除，获得一种能够高效异源表达蛋白酶(例如氨肽酶、碱性蛋白酶和角蛋白酶)的底盘菌株，提高了解淀粉芽孢杆菌异源蛋白质生产的能力，同时实现氨肽酶、碱性蛋白酶在解淀粉芽孢杆菌胞外的高效表达对其工业化生产具有重要意义。

10、本发明提供了一种能够高产氨肽酶、碱性蛋白酶和角蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌底盘菌株，在携带氨肽酶、碱性蛋白酶和角蛋白酶表达盒的情况下，分别摇瓶发酵，发酵上清液中重组碱性蛋白酶活力是对照菌表达活性的115％，重组氨肽酶活力是对照菌表达活性的125％，重组角蛋白酶活力是对照菌表达活性的121％。

技术特征：

1.一种解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌不表达解淀粉芽孢杆菌基因组上的六种胞外蛋白酶基因apre，bpr，vpr，mpr，npre，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs，sacb基因，和双组分系统调节蛋白yyci基因。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌的出发菌株为解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)cgmcc no.11218。

3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述双组分系统调节蛋白yyci基因编码的氨基酸序列如seq id no：1所示。

4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌基因组上的六种胞外蛋白酶基因apre，bpr，vpr，mpr，npre，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs，sacb基因，和双组分系统调节蛋白yyci基因被敲除。

5.一种生产氨肽酶的基因工程菌，其特征在于：在权利要求1所述基因工程菌的基础上，异源过表达氨肽酶基因ywad。

6.一种生产碱性蛋白酶的基因工程菌，其特征在于：在权利要求1所述基因工程菌的基础上，异源过表达碱性蛋白酶基因apre。

7.一种生产角蛋白酶的基因工程菌，其特征在于：在权利要求1所述基因工程菌的基础上，异源过表达角蛋白酶基因kerk。

8.利用权利要求1-7任一项所述基因工程菌生产蛋白酶的方法，包括：在培养基中培养所述基因工程菌以使其生产蛋白酶；以及，从所述基因工程菌和/或所述培养基中收集所述蛋白酶；其中，所述蛋白酶选自氨肽酶、碱性蛋白酶或角蛋白酶。

技术总结
本发明属于基因工程和酶工程领域，涉及工业微生物的育种，特别涉及一种用于生产蛋白酶的底盘菌株及其构建方法。本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，该基因工程菌不表达解淀粉芽孢杆菌基因组上的六种胞外蛋白酶基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs，sacB基因，和双组分系统调节蛋白yycI基因。并且利用所述底盘菌株实现异源蛋白酶的高效表达，所述蛋白酶选自氨肽酶、碱性蛋白酶或角蛋白酶。

技术研发人员：路福平,李庆刚,李玉,韩晓静,白孟欣,任绍东,孙雪,刘业学,刘逸寒
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/6