一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法。

背景技术：

1、自然杀伤细胞(natural killer cell,nk细胞)由骨髓淋巴样干细胞分化而来，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。不同于t细胞，nk细胞无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。最初，nk细胞靶向杀伤肿瘤的证据来自同种异体造血干细胞移植(hsct)治疗急性髓性白血病(aml)。nk细胞是hsct后首先恢复的淋巴细胞群，其中供体来源的同种异体反应性nk细胞(至少一个kir/hla与受体错配)，可以产生移植物抗白血病(gvl)效果并防治肿瘤复发。hsct后nk细胞的快速恢复对aml患者的临床预后具有积极意义，移植后30天nk细胞计数可作为移植预后的单一独立积极因素。因此过继性回输nk细胞是一种极具前途的肿瘤免疫治疗手段。

2、nk细胞在大多数人中仅构成总外周淋巴细胞的很小一部分(5％～25％)，且成熟nk细胞寿命较短(7～12天)，因此如何通过体外培养扩增，获取足够数量的细胞成为nk细胞过继疗法的关键技术瓶颈。

3、cd16是nk细胞主要的细胞毒性受体，可识别并结合肿瘤相关抗原结合igg的fc段，季介导细胞因子产生以及抗体依赖的细胞毒作用(adcc)，通过cd16的adcc作用是nk细胞发挥效应功能的主要机制之一，其依赖于免疫突触的形成和含有穿孔素和颗粒酶的溶解颗粒的脱颗粒，可以直接杀伤感染的病毒和肿瘤细胞。

4、nkg2d是nk细胞表面的c型凝集素家族受体，是nk细胞重要的激活性受体，在天然免疫中发挥着重要的作用，参与病毒感染细胞的识别及nk对肿瘤细胞的杀伤。当nkg2d与配体结合后，诱导细胞质中yxxm基序的磷酸化，然后激活下游磷酸肌醇3激酶(pi3k)信号通路，传递活化信号，nkg2d产生的信号可直接激活nk细胞发挥杀伤效应。因此，培养具有高表达效应的nk细胞对后续的临床推广及运用非常有必要。

5、此前，已有许多研究致力于开发nk细胞体外扩增的技术，以获得满足治疗需求的nk细胞数量。目前已经报道了数十种nk细胞的扩增方法，实现了超过千倍的扩增，而大部分方法只能产生很少的扩增(几十到数百倍)，并且技术尚未完全成熟。

6、现有体外扩增nk细胞方法存在以下缺点：1.需使用较多的蛋白类活性因子(如il-4、il-2、il-15、il-18、il-21等)，这些因子的价格较为昂贵，且不易保存和分装；2.需要预先一天包被培养瓶，增加了培养的不确定性，如果培养计划临时取消，会导致预先准备的材料无法使用，从而导致浪费；3.需要使用磁珠分选纯化的步骤，增加操作的难度及成本；4.目前培养基中都使用了血清或者血替，存在血清和血替引入的风险；5.扩增数量不够，nk细胞效应表型不高，难以满足未来临床推广时大量高效应表型的nk细胞需求。

7、因此，探索扩增高效、纯度高并且操作简便、低成本的扩增nk细胞方法十分必要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法。

2、本发明提供了一种nk细胞培养基，它是以nk无血清基础培养基为基础培养基，添加有终浓度为50iu/ml-300iu/ml的白细胞介素-2的培养基。

3、进一步地，所述白细胞介素-2终浓度为200iu/ml。

4、本发明一种nk细胞的培养方法，将外周血单个核细胞或nk细胞接种于上述的nk细胞培养基进行培养。

5、进一步地，包括以下步骤：

6、步骤(1)使用上述的nk细胞培养基，添加终密度为0.5e6/ml-1.5e6/ml的外周血单个核细胞与0.5e6/ml-1.5e6/ml的饲养细胞，进行培养；

7、步骤(2)培养第3天添加初始体积(0.5-2)倍的上述的nk细胞培养基继续培养；

8、步骤(3)再培养4天，添加此时nk细胞0.2-1倍的饲养细胞；

9、步骤(4)再继续培养7-15天。

10、进一步地，步骤(1)中所述外周血单个核细胞与饲养细胞比例为1:1；

11、步骤(2)中培养第3天添加初始体积1倍的上述的nk细胞培养基继续进行培养；

12、步骤(3)添加此时nk细胞0.5倍的饲养细胞；

13、步骤(4)中再继续培养10天。

14、进一步地，步骤(1)中所述外周血单个核细胞终浓度为1e6/ml。

15、进一步地，所述外周血单个核细胞将外周血进行分离，得到外周血单个核细胞。

16、进一步地，培养过程中，每1-2天补加上述的nk细胞培养基，控制nk细胞密度在0.5～1e6/ml之间。

17、进一步地，所述饲养细胞为表达il-21、4-1bbl、cd14、cd19及cd86的k-562细胞。

18、进一步地，所述饲养细胞为il-21nk细胞扩增试剂。

19、本发明提供一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法，本发明培养方法使用饲养细胞联合细胞因子刺激外周血单个核细胞(pbmc)中nk细胞的扩增，该方法使用pbmc细胞不需要进行磁珠分选，操作简单、成本低，仅添加饲养细胞及il-2，且il-2添加量少，仅需200iu/ml，且全程不需使用血清，不引入动物源成分，避免了血清和血替引入的风险。本发明培养基能够更好的刺激nk细胞扩增，通过17天的培养，可以获得大量高效应表型的nk细胞，培养过程简单，可以满足临床需要。

20、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

21、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

技术特征：

1.一种nk细胞培养基，其特征在于，它是以nk无血清基础培养基为基础培养基，添加有终浓度为50iu/ml-300iu/ml的白细胞介素-2的培养基。

2.根据权利要求1所述的nk细胞培养基，其特征在于，所述白细胞介素-2终浓度为200iu/ml。

3.一种nk细胞的培养方法，其特征在于，将外周血单个核细胞或nk细胞接种于权利要求1或2所述的nk细胞培养基进行培养。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

6.根据权利要求4或5所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述外周血单个核细胞终浓度为1e6/ml。

7.根据权利要求4或5所述的培养方法，其特征在于，所述外周血单个核细胞将外周血进行分离，得到外周血单个核细胞。

8.根据权利要求4或5所述的培养方法，其特征在于，培养过程中，每1-2天补加权利要求1或2所述的nk细胞培养基，控制nk细胞密度在0.5～1e6/ml之间。

9.根据权利要求4-8任意一项所述的方法，所述饲养细胞为表达il-21、4-1bbl、cd14、cd19及cd86的k-562细胞。

10.根据权利要求4-8任意一项所述的方法，所述饲养细胞为il-21nk细胞扩增试剂。

技术总结
本发明提供了一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法。本发明培养及是以NK无血清基础培养基为基础培养基，添加有终浓度为50IU/mL‑300IU/mL的白细胞介素‑2的培养基。本发明培养方法使用饲养细胞联合细胞因子刺激PBMC中NK细胞的扩增，使用PBMC细胞不需要进行磁珠分选，不需要进行提前包被，该方法操作简单、成本低，仅添加饲养细胞及IL‑2，且IL‑2添加量少，仅需200IU/mL，且全程不需使用血清，不引入动物源成分，避免了血清和血替引入的风险。本发明培养基能够更好的刺激NK细胞扩增，通过17天的培养，可以获得大量高效应表型的NK细胞，培养过程简单，可以满足临床需要。

技术研发人员：连通,余鼎,梁洪,刘东,姜琳
受保护的技术使用者：成都蓉生药业有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/6